ЭТАПЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

1. Формирование фермент-субстратного комплекса

Ферменты обладают высокой специфичностью и это позволило выдвинуть гипотезу, согласно которой активный центр фермента комплементарен субстрату, т.е. соответствует ему как «ключ замку». После взаимодействия субстрата «ключ» с активным центром «замок» происходят химические превращения субстрата в продукт.

Позднее был предложен другой вариант этой гипотезы – активный центр является гибкой структурой по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса. При этом субстрат также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции.

2. Последовательность событий в ходе ферментативного катализа

а. этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента

б. образование фермент-субстратного комплекса

в. деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт

г. распад комплекса фермент-продукт с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и освобождением фермента

3. Роль активного центра в ферментативном катализе

В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть фермента, от 5 до 10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Остальные аминокислотные остатки обеспечивают правильную конформацию молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции. В активном центре фермента субстраты располагаются так, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Такое расположение субстратов снижает энергию активации, что определяет каталитическую эффективность ферментов.

Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа:

1. кислотно-основной катализ

2. ковалентный катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований. Это цистеин, тирозин, серин, лизин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и гистидин.

Примером кислотно-основного катализа является окисление спирта с помощью фермента алкогольдегидрогеназы.

Ковалентный катализ основан на атаке «-» и «+» групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом. Примером является действие сериновых протеаз (припсин, хемотрипсин) на гидролиз пептидных связей при переваривании белков. Ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента.

Ферменты играют ключевую роль в метаболизме. Они ускоряют реакции, увеличивая их константы скоростей.

Рассмотрим энергетический профиль обычной реакции (рис. 12.I), проходящей в растворе по механизму столкновений А + В -> Р.

Образование продукта Р происходит, если энергия сталкивающихся молекул исходных веществ А и В превышает величину энергетического барьера. Очевидно, что можно ускорить эту реакцию, если каким-то образом уменьшить энергию активации &.Е ЗКГ

Общая схема ферментативной реакции, включает, как известно, образование единого фермент-субстратного комплекса, в активном центре которого и происходит разрыв старых и образование новых связей с появлением продукта.

В различных теоретических моделях механизма действия ферментов предлагаются разные способы понижения барьера реакции в фермент-субстратном комплексе. В результате фиксации субстрата на ферменте происходит некоторое снижение энтропии реагентов по сравнению с их свободным состоянием. Само по себе это облегчает дальнейшие химические взаимодействия между активными группами в фермент-субстратном комплексе, которые должны быть взаимно строго ориентированы. Предполагается также, что избыток энергии сорбции, который выделяется при связывании субстрата,

Рис. 12.1.

не переходит полностью в тепло. Энергия сорбции может быть частично запасена в белковой части фермента, а затем сконцентрироваться на атакуемой связи в области образовавшихся фермент-субстратных контактов.

Таким образом, постулируется, что энергия сорбции идет на создание низкоэнтропийной энергетически напряженной конформации в фермент-субстратном комплексе и тем самым способствует ускорению реакции. Однако экспериментальные попытки обнаружить упругие деформации, которые могли бы храниться в белковом глобуле фермента, не диссипируя в тепло в течение достаточно длительного времени между каталитическими актами (10 10 -3 с), не увенчались успехом. Более того, необходимая для

катализа взаимная ориентация и сближение расщепляемой связи субстрата и активных групп в центре фермента происходят спонтанно, вследствие внутримолекулярной подвижности разных, в том числе и активных, групп фермента и субстрата. Такое сближение не требует образования каких-либо энергетически неблагоприятных контактов. Этот вывод следует из анализа невалентных взаимодействий в активных центрах ряда ферментов (а-химотрипсин, лизоцим, рибонуклеаза, карбоксинептидаза). Таким образом, сама по себе напряженность конформации в фермент-субстратном комплексе не является необходимым источником энергии и движущей силой катализа.

В других моделях высказывается предположение о том, что в белковой глобуле происходит бездиссипативная передача энергии тепловых колебаний от наружных слоев белка к атакуемой связи в активном центре. Однако никаких серьезных доказательств этому нет, кроме утверждения о том, что фермент должен быть «устроен» так, чтобы его структура обеспечивала когерентный характер распространения флуктуационных изменений конформации без тепловых потерь по определенным степеням свободы.

Помимо отсутствия экспериментальных доказательств общим недостатком этих моделей является то, что в них не учитывается в явном виде важный фактор - спонтанная внутримолекулярная подвижность белка.

Шаг вперед в этом отношении сделан в конформационно-ре- лаксапионной концепции ферментативного катализа. В ней появление продукта рассматривается как результат последовательных конформационных изменений в фермент-субстратном комплексе, индуцированных первоначальными изменениями электронного состояния в активном центре фермента. Вначале, в течение короткого времени (10 |2 - 10 13 с), происходят электронно-колебательные взаимодействия, затрагивающие только выделенные химические связи субстрата и функциональные группы фермента, но не остальную часть белковой глобулы.

Вследствие этого создается конформационно-неравновесное состояние, которое релаксирует к новому равновесию с образованием продукта. Процесс релаксации происходит медленно и носит направленный характер, включая стадии отщепления продукта и релаксации свободной молекулы фермента к исходному равновесному состоянию. Координата ферментативной реакции совпадает с координатой конформационной релаксации. Температура же влияет на конформационную подвижность, а не на число активных соударений свободных молекул реагентов, что просто не имеет места в уже сформированном фермент-субстратном комплексе.

Вследствие больших различий в скоростях можно рассматривать отдельно быстрые электронные взаимодействия в активном центре, осуществляющиеся на коротких расстояниях, и более медленные конформационно-динамические изменения в белковой части.

На первом этапе катализа стохастический характер динамики белковой глобулы фермента и диффузии субстрата к активному центру приводят к образованию строго определенной конфигурации, включающей функциональные группы фермента и химические связи субстрата. Например, в случае гидролиза пептидной связи для реакции необходима одновременная атака субстрата двумя группами активного центра - нуклеофильной и электрофильной.

Пример 12.1. На рис. 12.2 приведено взаимное расположение расщепляемой пептидной связи субстрата и боковых цепей сер- 195, гис-51. Атом остатка сер-195 находится на расстоянии 2,8 А против карбонильного углерода С 1 , а протон гидроксильной группы, не нарушая водородной связи с атомом N гис-51 , располагается на расстоянии 2,0 А над атомом азота расщепляемой группы. При возникновении такой и только такой конфигурации происходит химический акт катализа. Формально это соответствует одновременному соударению нескольких молекул, что в растворе крайне маловероятно.

Возникает вопрос: какова вероятность спонтанного формирования такого рода реакционноспособной конфигурации в плотно структурированной среде за счет конформационных флуктуаций нескольких групп, происходящих по законам ограниченной диффузии?

Расчеты показывают, что существует вполне определенная вероятность одновременного попадания нескольких групп в «реакционную»

Рис. 12.2.

область некоторого радиуса, где они оказываются сближенными на короткие расстояния. Эта вероятность зависит главным образом от коэффициента диффузии и числа степеней свободы функциональных групп, «ищущих» друг друга в ограниченном пространстве. Например, при гидролизе пептидной связи необходимо создать благоприятную ориентацию для двух групп активного центра относительно определенных участков субстрата. Каждая из групп обладает тремя степенями свободы, а с учетом вибраций молекулы субстрата общее число степеней свободы N - 6 - 7. Это типично для ферментативных процессов.

Оказывается, что в обычных условиях среднее время образования такой активной конфигурации составляет т ~

10 2 - 1СИс, что совпадает с временами оборота фермента в условиях субстратного насыщения. В растворе для аналогичной реакции это время намного больше даже при значительных коэффициентах диффузии. Причина состоит в том, что, попав в ограниченную область в плотно структурированной среде, функциональные группы «находят» друг друга и сближаются на короткие расстояния раньше, чем они «разбегутся» в разные стороны, как это происходит в растворе. Вместе с тем величина т - 10~ 2 - 1СНс намного больше, чем времена релаксаций отдельных групп, что является следствием достаточно жестких стерических условий для протекания реакции. Увеличение числа функциональных групп и необходимых одновременных контактов между ними приводит к увеличению времени достижения многоцентровой активной конфигурации. Общая скорость ферментативного катализа определяется именно временем образования нужной конформации при спонтанном сближении соответствующих групп в активном центре. Следующие за этим электронные взаимодействия происходят гораздо быстрее и не лимитируют общую скорость катализа.

Существует ряд особенностей ферментов, облегчающих превращение субстрата в активном центре. Как правило, микросреда активного центра с его аминокислотными остатками более гидро- фобна, чем окружающая водная среда. Это снижает значение диэлектрической постоянной активного центра (е

Высокая локальная концентрация диполей пептидных связей создает в активном центре электрические поля напряженностью порядка тысяч и сотен тысяч вольт на сантиметр. Таким образом, ориентированные полярные группы создают внутриглобулярное электрическое поле, влияющее на кулоновские взаимодействия в активном центре.

Механизмы самих электронных переходов в активной конфигурации требуют для своей расшифровки привлечения методов квантовой химии. Перекрывание электронных орбиталей может привести к перераспределению электронной плотности, появлению дополнительного заряда на разрыхляющей орбитали атакуемой связи в субстрате и ее ослаблению.

Именно это и происходит при гидролизе пептидной связи в тетраэдрическом комплексе (см. рис. 12.2). Стекание электронной плотности от Ofoj-cep-195 на разрыхляющую орбиталь в пептидной связи происходит за счет взаимодействия неподеленной пары электронов 0[ 95 5 с я-электронами атома С 1 пептидной связи. При этом нело- деленная пара азота аминной группы выталкивается из пептидной

Рис. 12.3.

связи N=C", которая утрачивает двойной характер и в результате ослабляется.

Одновременно отекание электронной плотности от 0,95 ослабляет и связь Н-О^. Но тогда облегчается взаимодействие Н фермента и N аминной группы и ее протонирование с переходом протона от 0"[ ч5 к гис-57. В свою очередь это опять увеличивает взаимодействие Oj9 5 c пептидной группой и т.д.

Таким образом, в тетраэдическом комплексе создается уникальная ситуация, когда несколько мономолекулярных реакций протекают одновременно, взаимно ускоряя друг друга. Синхронное перемещение заряда и протона между сер- 195, гис-57, пептидной связью обеспечивает высокую эффективность процесса. Каталитический акт сводит в единую кооперативную систему три отдельные бимолекулярные реакции, ведущие к разрыву пептидной связи - событию, маловероятному в растворе. В системе индицируются естественные конформационные перестройки и в итоге происходит деацилирова- ние фермента и протонирование атома 0} 95 .

Принцип образования полифункциональной замкнутой системы атомных групп в активной конфигурации выполняется и в других фермент-субстратных комплексах (рис. 12.3).

В ферментативном катализе многостадийный характер превращений субстрата, маловероятный в растворе, обеспечивается за счет синхронного кооперативного их протекания в единой полифункцио- нальной системе.

Замена малоэффективных последовательных активационных стадий скоординированным процессом приводит формально к снижению энергии активации всей реакции. Заметим еще раз, что, строго говоря, физический смысл понятия «энергия активации» в ферментативных процессах не соответствует таковому для реакций в растворах, идущих по механизму активных столкновений свободных молекул.

Последовательность событий в ферментативном катализе можно описать следующей схемой. Вначале формируется субстрат-ферментный комплекс. При этом происходит изменение конформаций ферментной молекулы и молекулы субстрата, последняя фиксируется в активном центре в напряженной конфигурации. Так формируется активированный комплекс, или переходное состояние , - высокоэнергетическая промежуточная структура, которая энергетически менее устойчива, чем исходные соединения и продукты. Важнейший вклад в суммарный каталитический эффект вносит процесс стабилизации переходного состояния -взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом, находящимся в напряженной конфигурации. Разность значений свободной энергии для исходных реагентов и переходного состояния соответствует свободной энергии активации (ΔG #). Скорость реакции зависит от величины (ΔG #) : чем она меньше, тем больше скорость реакции, и наоборот. По сути DG представляет собой «энергетический барьер», который требуется преодолеть для осуществления реакции. Стабилизация переходного состояния понижает этот «барьер» или энергию активации. На следующем этапе происходит сама химическая реакция, после чего образовавшиеся продукты освобождаются из фермент-продуктного комплекса.

Можно выделить несколько причин высокой каталитической активности ферментов, которые обеспечивают снижение энергетического барьера реакции.

1. Фермент может связывать молекулы реагирующих субстратов таким образом, что их реакционноспособные группы будут располагаться поблизости друг от друга и от каталитических групп фермента (эффект сближения ).

2. При образовании субстрат-ферментного комплекса достигаются фиксация субстрата и его оптимальная для разрыва и образования химических связей ориентация (эффект ориентации ).

3. Связывание субстрата приводит к удалению его гидратной оболочки (существует на растворенных в воде веществах).

4. Эффект индуцированного соответствия субстрата и фермента.

5. Стабилизация переходного состояния.

6. Определенные группы в молекуле фермента могут обеспечивать кислотно-основный катализ (перенос протонов в субстрате) и нуклеофильный катализ (формирование ковалентных связей с субстратом, что приводит к образованию более реакционноспособных структур, чем субстрат).

Одним из примеров кислотно-основного катализа является гидролиз гликозидных связей в молекуле муреина с помощью лизоцима. Лизоцим представляет собой фермент, присутствующий в клетках различных животных и растений: в слезной жидкости, слюне, курином белке, молоке. Лизоцим из куриных яиц имеет молекулярную массу 14 600 Да, состоит из одной полипептидной цепи (129 аминокислотных остатков) и имеет 4 дисульфидных мостика, что обеспечивает высокую стабильность фермента. Рентгеноструктурный анализ молекулы лизоцима показал, что она состоит из двух доменов, образующих «щель», в которой находится активный центр. Вдоль этой «щели» связывается гексосахарид, причем для связывания каждого из шести сахарных колец муреина на ферменте имеется свой участок (А, В, С, D, E и F) (рис. 6.4).

Молекула муреина удерживается в активном центре лизоцима в основном благодаря водородным связям и гидрофобным взаимодействиям. В непосредственной близости к месту гидролиза гликозидной связи расположены 2 аминокислотных остатка активного центра: глутаминовая кислота, занимающая 35-е положение в полипептиде, и аспарагиновая кислота - 52-е положение в полипептиде (рис. 6.5).

Боковые цепи этих остатков располагаются на противоположных поверхностях «щели» в непосредственной близости к атакуемой гликозидной связи - примерно на расстоянии 0,3 нм. Остаток глутамата находится в неполярном окружении и не ионизирован, а остаток аспартата- в полярном окружении, его карбоксильная группа депротонирована и участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей.

Процесс гидролиза осуществляется следующим образом. Протонирован карбоксильная группа остатка Glu-35 предоставляет свой протон гликозидному атому кислорода, что приводит к разрыву связи между этим атомом кислорода и С 1 -атомом сахарного кольца, располагающегося в участке D (стадия общего кислотного катализа). В результате образуется продукт, включающий в себя сахарные кольца, находившиеся в участках E и F, который может высвободиться из комплекса с ферментом. Конформация сахарного кольца, расположенного в участке D, искажается, принимая конформацию полукресла , в которой пять из шести атомов, образующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости. Эта структура соответствует конформации переходного состояния. При этом С 1 -атом оказывается положительно заряженным и промежуточный продукт носит название карбоний-иона (карбкатиона). Свободная энергия переходного состояния уменьшается за счет стабилизации карбоний-иона депротонированной карбоксильной группой остатка Asp-52 (рис. 6.5).

На следующем этапе в реакцию вступает молекула воды, которая замещает диффундирующий из области активного центра дисахаридный остаток. Протон молекулы воды переходит к Glu-35, а гидроксильный ион (ОН -) к атому С 1 карбоний-иона (стадия общего основного катализа). В результате второй фрагмент расщепленного полисахарида становится продуктом реакции (конформация кресла) и уходит из области активного центра, а фермент возвращается в исходное состояние и готов осуществить следующую реакцию расщепления дисахарида (рис.6.5).

Катализ – это процесс ускорения химической реакции под влиянием катализаторов, которые активно участвуют в ней, но к концу реакции остаются химически неизмененными. Катализатор ускоряет установление химического равновесия между исходными веществами и продуктами реакции. Энергия, необходимая для начала химической реакции, называется энергией активации . Она необходима, чтобы молекулы, участвующие в реакции, могли перейти в реакционно-способное (активное) состояние. Механизм действия фермента направлен на то, чтобы понизить энергию активации. Это достигается разделением реакции на отдельные шаги или этапы благодаря участию самого фермента. Каждый новый этап обладает более низкой энергией активации. Разделение реакции на этапы становится возможным благодаря образованию комплекса фермента с исходными веществами, так называемыми субстратами (S ). Такой комплекс называется фермент-субстратным (ES ). Далее этой комплекс расщепляется с образованием продукта реакции (Р) и неизмененного фермента (Е ).

E + S ES E + P

Таким образом, фермент – это биокатализатор, который путем образования фермент – субстратного комплекса разбивает реакцию на отельные этапы с более низкой энергией активации и тем самым резко повышает скорость реакции.

4. Свойства ферментов.

Все ферменты - белковой природы.

Ферменты обладают высокой молекулярной массой.

Они хорошо растворимы в воде, при растворении образуют коллоидные растворы.

Все ферменты - термолабильны, т.е. оптимум действия 35 – 45 о С

По химическим свойствам являются амфотерными электролитами.

Ферменты высокоспецифичны по отношению к субстратам.

Ферменты для своего действия требуют строго определенного значения рН (пепсин 1.5 – 2.5).

Ферменты обладают высокой каталитической активностью (ускоряют скорость реакции в 10 6 – 10 11 раз).

Все ферменты способны к денатурации по воздействием сильных кислот, щелочей, спиртов, солей тяжелых металлов.

Специфичность действия ферментов:

По специфичности действия ферменты делятся на две группы: обладающие абсолютной специфичностью и с относительной специфичностью.

Относительная специфичность наблюдается, когда фермент катализирует реакции одного типа с более чем одним структуроподобным субстратом. Например, пепсин расщепляет все белки с животного происхождения. Такие ферменты действуют на определенный тип химической связи, в данном случае на пептидную связь. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов.

Абсолютная специфичность проявляется тогда, когда фермент действует лишь на одно-единственное вещество и катализирует лишь определенное превращение данного вещества. Например, сахараза расщепляет только сахарозу.

Обратимость действия:

Некоторые ферменты могут катализировать как прямую реакцию, так и обратную. Например, лактатдегидрогеназа, фермент катализирующий окисление лактата до пирувата и восстановление пирувата до лактата.

Любая каталитическая реакция предполагает изменение скоростей как прямой, так и обратной реакции за счет снижения ее энергетики. Если хими­ческая реакция протекает с выделением энергии, то она должна начинаться спонтанно. Однако этого не происходит, потому что компоненты реакции должны быть переведены в активированное (переходное) состояние. Энергия, необходимая для перевода реагирующих молекул в активированное состояние, называется энергией активации .

Переходное состояние характери­зуется непрерывным образованием и разрывом химических связей, причем между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие. Скорость прямой реакции зависит от температуры и разности значений свободной энергии для субстрата в переходном и основном состоя­ниях. Эта разность называется свободной энергией реакции .

Достижение переходного состояния субстрата возможно двумя путями:

• за счет передачи реагирующим молекулам избыточ­ной энергии (например, за счет увеличе­ния температуры),
• за счет снижения энергии активации соответствующей химической реакции.

Основное и переходное состояния реагирующих веществ.

Ео, Ек - энергия активации реакции без и в присутствии катализатора; DG -

разность свободной энергии реакции.

Ферменты «помогают» субстратам принять переходное состояние за счет энергии связывания при образовании фермент-субстратного комплекса . Сни­жение энергии активации при фермента­тивном катализе обусловлено увеличе­нием числа стадий химического процес­са. Индуцирование ряда промежуточных реакций приводит к тому, что исходный активационный барьер дробится на несколько более низких барьеров, преодо­леть которые реагирующие молекулы могут гораздо быстрее, чем основной.

Механизм ферментативной реакции можно представить следу­ющим образом:

1. соединение фермента (Е) и субстрата (S) с образованием не­стойкого фермент-субстратного комплекса (ES): Е + S → E-S;
2. образование активированного переходного состояния: Е-S → (ES)*;
3. высвобождение продуктов реакции (Р) и регенерация фермен­та (Е): (ES)* → Р + Е.

Для объяснения высокой эффективности действия энзимов было предложено несколько теорий механизма ферментативного катализа. Наиболее ранней является теория Э. Фишера (теория «шаблона» или «жесткой матрицы »). Согласно этой теории фермент является жест­кой структурой, активный центр которой представляет собой «сле­пок» субстрата. Если субстрат подойдет к активному центру фермен­та как «ключ к замку», то произойдет химическая реакция. Эта тео­рия хорошо объясняет два типа субстратной специфичности фермен­тов - абсолютную и стереоспецифичность, но оказывается несостоя­тельной при объяснении групповой (относительной) специфичности ферментов.

Теория «дыбы» основана на представлениях Г. К. Эйлера, изучав­шего действие гидролитических ферментов. По этой теории фермент связывается с молекулой субстрата в двух точках, при этом происходит растяжение химической связи, перераспределение элек­тронной плотности и разрыв химической связи, сопровождающий­ся присоединением воды. Субстрат до присоединения к ферменту имеет «расслабленную» конфигурацию. После связывания с активным центром молекула субстрата подвергается растяжению и деформации (располагается в активном центре как на дыбе). Чем больше длина химических связей в субстрате, тем легче они разрываются и тем меньше энергия активации химической реакции.

В последнее время нашла широкое распространение теория «ин­дуцированного соответствия» Д. Кошланда, которая допускает высо­кую конформационную лабильность молекулы фермента, гибкость и подвижность активного центра. Субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата простран­ственную ориентацию, т. е. субстрат подходит к активному центру как «рука к перчатке».

Согласно теории индуцированного соответствия механизм взаи­модействия фермента и субстрата следующий:

1. фермент по принципу комплементарности распознает и «ловит» молекулу субстрата. В этом процессе белковой молекуле помога­ет тепловое движение ее атомов;
2. аминокислотные остатки активного центра смещаются и под­страиваются по отношению к субстрату;
3. химические группировки ковалентно присоединяются в активном центре - ковалентный катализ.