Вирусологические исследования. Вирусологические методы исследования Прямые методы исследования в вирусологии

Основными методами, используемыми в диагностике вирусных болезней, являются культивирование и идентификация вирусов.

Для доказательства вирусной этиологии болезни необходимо: выделение вируса из организма больной рыбы, пассирование его на культуре клеток или чувствительных рыбах, воспроизведение болезни у здоровых рыб того же или родственного вида, повторное выделение того же вируса от экспериментальных животных.

Для идентификации вирусов используют несколько взаимодополняющих методов: электронная микроскопия вируса, изучение его физико-химических свойств, обнаружение характерных морфологических изменений в зараженных клетках и симптомов у зараженных животных, различные иммунологические методы.

Вирусы выделяют в основном на однослойных первичных или перевиваемых клеточных культурах, подбирая в каждом случае культуры, чувствительные к данному вирусу. Для получения первичных культур клеток рыб наиболее часто используют гонады самок карпа или карася. Гонады должны быть II или II-III стадии зрелости по шкале Киселевича. Такие гонады не содержат икринок, различимых невооруженным глазом. В противном случае содержимое икринок будет отрицательно влиять на рост клеток. Культуры клеток из гонад карпа и карася готовят по утвержденной методике.

В качестве перевиваемых культур наиболее широко используют следующие клеточные линии: FHM - из тканей хвостового стебля жирноголового гольяна; RTG- из гонад радужной форели; ЕРС - из оспенных разростов на коже карпа. Названные линии поддерживаются в специализированных лабораториях по изучению болезней рыб ветеринарных и рыбохозяйственных научно-исследовательских институтов, где их можно заказать и получить.

При диагностике хорошо изученных вирусных болезней исследуют органы и ткани, где концентрируется возбудитель.

При болезнях рыб, сведения о которых недостаточны, вирусологическому исследованию подвергают наиболее пораженные органы. Соскобы с кожи и жабр, кусочки этих органов вместе со слизью помещают в стерильные флаконы с 2-3 мл стерильного физиологического или буферного раствора. Пробы из внутренних органов берут в строго асептических условиях.

В тех случаях, когда быстро исследовать материал невозможно, его сохраняют не более суток в холодильнике при температуре не выше 5°С. Материал в замороженном состоянии можно сохранять более длительное время.

Предназначенный для исследования патологический материал измельчают в гомогенизаторе или растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком. Из измельченных тканей готовят 10 %-ную суспензию на растворах Хенкса, Эрла, буферном или физиологическом растворе и центрифугируют 10-15 мин при 2000-3000 об/мин, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой и помещают в стерильные флаконы. Если суспензия не стерильна, подготовленные материалы фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2-0,45 мкм или обрабатывают антибиотиками (пенициллин 1000 ЕД/мл и стрептомицин 1000 мкг/мл).

Из кишечного содержимого готовят 20 %-ную взвесь в стерильной дистиллированной воде и центрифугируют 10-15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость центрифугируют повторно при 4000-5000 об/мин в течение 30 мин. Затем надосадочную жидкость отсасывают в стерильный флакон и обрабатывают антибиотиками. На 1 мл добавляют 1000 мкг/мл стрептомицина и 1000 ЕД/мл пенициллина. Смесь выдерживают 2-3 ч при: комнатной температуре. Все материалы проверяют на бактериальную стерильность путем посева на МПБ и МПА. Приготовленные материалы сразу используют для работы или, в крайнем случае, сохраняют в замороженном состоянии (при температуре минус 20°С).

Заражение культуры клеток . Для заражения используют пробирки с хорошим клеточным монослоем или зоной роста вокруг эксплантата. Питательную среду отсасывают и в каждую пробирку вносят по 0,2-0,3 мл исследуемой суспензии. Одновременно в пробирки добавляют по 0,8-0,9 мл питательной среды с 2-3 % сыворотки.

Материалом, приготовленным из каждой пробы, заражают культуру тканей в 4-6 пробирках. Из каждой серии исследований столько же пробирок оставляют в качестве контроля, добавляя в них по 1 мл питательной среды. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч для адсорбции вируса на клетках, затем отсасывают пипеткой надосадочную жидкость и вносят поддерживающую питательную среду до первоначального объема.

Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре 22-26°С и ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для обнаружения появившихся морфологических изменений в клетках. При выраженной дегенерации клеток культуральную жидкость отсасывают и делают пассажи, а при отсутствии цитопатогенного действия (ЦПД) проводят два последовательных пассажа. Для этого используют культуральную жидкость вместе с клеточной фракцией, разрушенной путем повторного замораживания и оттаивания. Для заражения свежих культур используют надосадочную жидкость центрифугированной клеточной массы. ЦПД после третьего пассажа учитывают как специфическое действие вирусного агента.

Степень поражения клеточного монослоя оценивается по 4-крестовой системе; " + - поражение до 25%, "+ + " - до 50%, "+ + +" - до 75% и "+ + + + " - до 100 % монослоя.

При некоторых вирусных заболеваниях рыб в клетках (цитоплазме ядре) различных органов и тканей появляются тельца-включения. Материалом для исследования вирусных включений служат инфицированные культуры тканей, соскобы и мазки-отпечатки из органов и тканей, казанные материалы перед окраской фиксируют по общепринятым методам, спользуя жидкости Дюбоск - Бразил - Буэна, Буэна, Карнуа или 10 %-ный раствор нейтрального формалина.

Вирусные включения окрашивают различными методами: по Муромцеву, рубиной, Манну, Селлексу, Клисенко, Романовскому-Гимзе, Май-Грюн-альду - Гимзе и др.

Титрование вируса - количественное определение вирусной активности. Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся единице объема суспензии вируса. За инфекционную единицу вируса принимается такая его доза, которая вызывает инфекцию у 50 % зараженных ею чувствительных объектов. Такая доза вируса называется инфекционной и обозначается ИД 50 .

В качестве чувствительных объектов при титровании вирусов рыб используют главным образом культуры клеток. Титрование на культуре клеток осуществляют по цитопатогенному действию вирусов. В этом случае ИД 50 называют тканевой цитопатогенной дозой (ТЦД 50), а титр вируса выражают количеством ТЦД 50 в 1 мл вирусной суспензии. Титр вируса при этом определяют методом конечных разведений. Согласно этому методу чувствительные культуры клеток вводят определенный объем суспензии вируса в последовательно возрастающих разведениях и, учитывая результат к аждого введения как положительный (если есть ЦПД) или отрицательный если ЦПД отсутствует), рассчитывают конечную точку титрования - 1 ТЦД 50 .

Для титрования вирусов, дающих ярко выраженное ЦПД, используют также метод бляшек. При этом зараженный вирусом монослой клеток заливают смесью питательной среды с агаром, чтобы предотвратить перенос вируса на другие клетки, значительно удаленные от первично инфицированных, и иметь возможность инфицировать первоначальные очаги заражения бляшки).

Каждая бляшка возникает из одной инфекционной единицы, которую обозначают БОЕ (бляшкообразующая единица), а титр вируса выражают количеством БОЕ в единице объема суспензии.

Реакция нейтрализации (РН) на культуре клеток .

В основе реакции лежит связывание антигена антителами гомологичной антисыворотки. Реакцию используют для идентификации возбудителей при диаг-остике заболеваний вирусной этиологии. Она позволяет определять по из-естным антителам неизвестный вирусный антиген или по заведомо известному (стандартному) антигену - неизвестные антитела в сыворотках больных ли переболевших рыб.

Определение выделенного вируса в реакции нейтрализации проводят, применяя набор диагностических гипериммунных антисывороток (антител) гомологичных к ним антигенов (вирусов).

Гипериммунные антисыворотки получают при заражении лабораторных животных (например, кроликов) известными штаммами вирусов - возбудителей болезней рыб. У полученных антисывороток определяют титры специфических антител. Для работы берут антисыворотки, содержащие антитела в высоких титрах.

Порядок проведения реакции.

1. Инактивирование нормальной и гипериммунной сыворотки прогреванием при 56 о С в течение 30 мин.

2. Приготовление разведений ингредиентов реакции. Питательной средой без сыворотки и антибиотиков разводят антиген и сыворотки, начиная с 1: 5, 1: 50, 1: 500 и до получения разведения содержанием менее 1 ТЦД 50 /0,2 мл. Гипериммунную сыворотку разводят 1: 2 или 1: 5. При малом титре сыворотку используют неразведенной. Нормальную сыворотку разводят так же, как и гипериммунную.

3. Постановка реакции. В штативе размещают три ряда стерильных пробирок. В первый ряд разливают разведенную гипериммунную сыворотку, во второй - разведенную нормальную сыворотку, в третий - питательную среду. Каждый ингредиент вносят в объеме 0,5 мл.

Приготовленные разведения вируса переносят по 0,5 мл в соответствующие пробирки каждого из трех рядов, причем вирус каждого разведения I переносят отдельной пипеткой, начиная с наибольшего разведения. Таким образом, в каждом ряду пробирок получают последовательные 10-кратные разведения вируса: 10-1, 10-2 и т. д.

Для контроля токсичности сывороток в отдельную пробирку вносят 0,5 мл приготовленного разведения гипериммунной сыворотки, а затем прибавляют равное количество питательной среды. То же проделывают с нормальной сывороткой.

Пробирки со смесями тщательно встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем заражают культуру клеток каждым разведением вируса (0,2 мл на каждую пробирку) с гипериммунной нормальной сыворотками и питательной средой по 4 пробирки культуры клеток. Параллельно ставят контроли на токсичность используемых клеток и контрольные пробы культуры клеток.

Пробирки с культурой клеток инкубируют в термостате при оптимальной для размножения данного вируса температуре, ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для обнаружения ЦПД вируса. Результаты заносят в таблицу (табл. 11).

Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся в единице объема суспензии вируса. Находят индекс нейтрализации (IN). Он соответствует максимальному количеству ИД 50 , которое может быть нейтрализовано гипериммунной сывороткой. Расчет IN ведут по формуле: lgIN = lgT 1 -lgT 2 , где Т 1 - титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Т 2 - титр вируса в присутствии гипериммунной сыворотки. Значение IN находят по таблице антилогарифмов. Принято считать значение IN до 10 отрицательным, от 10 до 49 - сомнительным, 50 и более - положительным результатом.

Результаты реакции можно считать достоверными только в том случае если гипериммунная сыворотка проверена на специфическую нейтрализующую активность. Для этого предварительно определяют титр нейтрализующих антител в этой сыворотке или ее индекс нейтрализации в реакции с гомологичным вирусом.

Выделение рабдовирусов методом бляшек . Данный метод специфический, применяют его для выделения, предварительного типирования и селекции рабдовирусов карпа, форели при наличии специфических иммунных сывороток для идентификации вируса.

Округлые колонии (бляшки) образуются в клеточных культурах под агаровым покрытием при наличии вируса в исследуемом материале.

В асептических условиях пастеровской пипеткой набирают ткань почек, печени, селезенки и жидкость из брюшной полости, переносят во флакон со средой, содержащей по 500 ME (мкг)/мл антибиотиков в соотношении 1: 10. выдерживают 60-90 мин при температуре 18-22°С, затем центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разводят питательной средой 1: 10 (разведение 1: 100). Для заражения клеточных культур используют надосадочные жидкости обоих разведений.

Для исследования отбирают 3-суточную перевиваемую культуру клеток, выращенную в матрацах с хорошо выраженным монослоем, из расчета 2 матраца на каждое разведение патологического материала и по 2 матраца для контроля. Из флаконов удаляют питательную среду и вносят по 2 мл среды без эмбриональной сыворотки. Затем вносят по 0,2 мл исследуемого патматериала и оставляют для адсорбции вируса на 60 мин при температуре оптимальной для вирусов, поражающих рыб (для вирусов карпа - 24-26°С и для вирусов форели-16-18°С).

Контроль ставят в 2 матрацах с клеточными культурами по 0,2 мл, содержащих по 100 ТЦД 50 /мл известного вируса, а в 2 - по 0,2 мл питательной среды без вируса.

Через 60 мин жидкость из флаконов удаляют. По стенке, противоположной монослою, вносят во флакон емкостью 50 мл 5 мл агарового покрытия, нагретого до 40-42°С (при выделении вируса ВГС - не более 38°С). Матрацы поворачивают монослоем вниз, покрывают черной бумагой. Через 15-20 мин матрацы переносят для инкубации при оптимальной для изучаемых вирусов температуре. Матрацы кладут агаровым покрытием вверх. При неизвестном вирусе культуры содержат при двух температурных режимах - 14-18 и 22-24°С.

Зараженные клеточные культуры просматривают на белом фоне. При наличии в изучаемом материале вируса в клеточной культуре вначале появляются прозрачные точки на розово-матовом фоне культуры. В дальнейшем они увеличиваются в размере, образуя круглые прозрачные колонии - бляшки, наличие которых свидетельствует о наличии в патматериале рабдовирусов.

Пастеровской пипеткой набирают кусочек бляшки на границе пораженной и непораженной части с таким расчетом, чтобы попал не только агаровый, но и клеточный слой. Отобранный кусочек помещают в пробирку с 1 мл ростовой среды, замораживают при минус 20°С и выдерживают 60 мин. В случае большого количества бляшек (весь клеточный слой прозрачный) исследования повторяют в разведениях 10 -3 и 10 -4 .

Бляшки диаметром 3-8 мм рабдовируса карпа на перевиваемой культуре ЕРС и FHM, инкубируемой при температуре 24-26°С, проявляются на 4-7-й день.

При отсутствии бляшек и наличии ЦПД в клеточных культурах проводят дополнительные исследования вируссодержащей культуральной жидкости в разведениях 10 -2 -10 -3 (2-3 пассажа). В качестве дополнительных методов идентификации вирусов используют: метод флуоресцирующих антител; определение чувствительности вируса к хлороформу, эфиру, величине рН, нагреванию; электронно-микроскопическое исследование морфологии вирусов.

Вирусологическое исследование включает два основных этапа: выделение вирусов и их идентификацию. Материалом для вирусологического исследования могут быть кровь, другие биологические и патологические жидкости, биоптаты органов и тканей.

Вирусологическое исследование крови часто проводят с целью диагностики арбовирусных инфекций. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса, Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа и других ОРВИ, кори. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеро-, адсно-, рсо-, нора- и ротавирусы.

Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных.

Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности, например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, поэтому для выделения определенного вируса используют соответствующую культуру ткани. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться чувствительной. Наличие вируса в зараженных культурах клеток определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. цитопатоген ном у действию, обнаружению внутриклеточных включений, а также на основе выявления специфического антигена методом иммунофлуоресценции, положительных реакций гемадсорбции и гемагглютинации.

Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Чате всего используют эмбрионы кур. При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (арбовирусы), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях те маг гл ютин ино в (вирусы гриппа, паротита) и комплементе вязывающего вирусного антигена.

Идентификация вирусов осуществляется, с помощью иммунологических методов: реакция торможения гемагтлютинации, связы- кание комплемента, нейтрализация, преципитация в геле, иммунофлуоресценция.

Еще по теме Вирусологический метод:

Оценка основных антропометрических данных параметрическим методом (сигмальный метод)
Лечение по методу угашения условной связи и методу форсированной тренировки
2. Сравнительно-правовой метод – частнонаучный метод юридической науки
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И ВЫБОР МЕТОДА ЛЕЧЕНИЯ СУБМУКОЗНОЙ МИОМЫ МАТКИ
5.4. Понятие и структура общего метода расследованиякак метода практической деятельности
Тема 8. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯИЗМЕНЧИВОСТИ И МЕХАНИЗМОВ ПЕРЕДАЧИНАСЛЕДСТВЕННОЙ ИНФОРМАЦИИ. ПРИМЕНЕНИЕГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Тема 15. ПАТОГЕННОСТЬ И ВИРУЛЕНТНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ. ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ. МЕТОДЫ ЗАРАЖЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ. АНТИГЕНЫ, МЕТОДЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ. АНТИТЕЛА. РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ. ФАГОЦИТОЗ

Вирусологические методы исследования

методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

В зараженных клеточных культурах можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его - клонированием.

Для выделения вирусов применяют восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2-3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов - новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит ткани, образуются и вирусоспецифические . Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная , а также , метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из , секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. основана на гибридизации комплементарных нитей или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем класса G (на 3-5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую - через 2-3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары - антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций - вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Библиогр.: Букринская А.Г. , М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, . с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Смотреть что такое "Вирусологические методы исследования" в других словарях:

Имеют целью обнаружение вирусов, их отождествление (идентификацию) и изучение биологических свойств. Для выделения вирусов (См. Вирусы) от человека, животных и растений исследуемый материал вводят в организм чувствительных к вирусам… … Большая советская энциклопедия

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - вирусологические исследования, комплекс методов исследования, позволяющих распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.Основными этапами В. и. являются выделение вируса от больных и павших животных (взятие, консервирование … Ветеринарный энциклопедический словарь

ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. см. ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Важнейшим условием получения достоверных результатов исследований является правильный выбор объектов анализа, своевременный их отбор и формулировка задачи исследования. Правила отбора проб … Болезни рыб: Справочник

Учреждения системы здравоохранения либо структурные подразделения лечебно профилактических или санитарно профилактических учреждений, предназначенные для проведения различных медицинских исследований. В эту группу не входят научно… … Медицинская энциклопедия

I Эпидемиология (Эпидемия + греч. logos учение) наука, изучающая закономерности эпидемического процесса и разрабатывающая меры борьбы с заразными болезнями человека. Исторически Э. сложилась как научная дисциплина, объектом изучения которой… … Медицинская энциклопедия

I Вирусология (вирус [ы] (Вирусы) + греч. logos учение) медико биологическая наука, изучающая вирусы. Возникла в конце 19 в., когда русский ученый Д.И. Ивановский (1892) впервые установил существование мельчайших микроорганизмов, вызывающих… … Медицинская энциклопедия

- (синонимы: клещевой энцефаломиелит, весенне летний энцефалит, весенне летний менингоэнцефалит, таежный энцефалит, русский дальневосточный энцефалит) инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, интоксикацией и преимущественным поражением… … Медицинская энциклопедия

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные - в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2-3 пассажей вируса.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3-5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген - антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций - изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Библиогр.: Букринская А.Г. Вирусология, М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, пер. с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.

- методы обезвреживания отбросов, содержащих органические вещества, основанные на их разогревании в результате жизнедеятельности термофильных аэробных микроорганизмов...
Медицинская энциклопедия
- гистохимические методы выявления ферментов, основанные на реакции образования осадков фосфата кальция или магния в местах локализации ферментативной активности при инкубации срезов тканей с органическими...
Медицинская энциклопедия
- методы выявления гистиоцитов в препаратах нервной ткани и различных органов с помощью аммиачного серебра или пиридиново-содовых растворов серебра...
Медицинская энциклопедия
- методы оценки предположений о характере наследования, основанные на сопоставлении наблюдаемых и ожидаемых соотношений больных и здоровых в семьях, отягощенных наследственными болезнями, с учетом способа...
Медицинская энциклопедия
- применяются для изучения строения и функции клеток и тканей человека, животных и растительных организмов в норме, патологии и эксперименте...
Медицинская энциклопедия
- методы идентификации химических веществ в гистологических срезах. Составной частью Г. м. и. являются цитохимические методы, выявляющие химические вещества в клетках приготовленных мазков и отпечатков...
Медицинская энциклопедия
- методы количественного и качественного определения глюкозы в крови и моче, основанные на окислении глюкозы кислородом воздуха в присутствии фермента глюкозооксидазы...
Медицинская энциклопедия
- диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител...
Медицинская энциклопедия
- методы выявления волокнистых структур соединительной ткани и нейроглии в гистологических препаратах, основанные на их многоцветной окраске...
Медицинская энциклопедия
- 1) метод окраски гистологических препаратов дермы с помощью гемалауна Майера, раствора калийных квасцов и родамина; ядра клеток окрашиваются в синий цвет, элеидин - в красный...
Медицинская энциклопедия
- в медицине - совокупность методов количественного изучения и анализа состояния и поведения объектов и систем, относящихся к медицине и здравоохранению...
Медицинская энциклопедия
- способы изучения различных объектов с помощью микроскопа...
Медицинская энциклопедия
- основаны на использовании законов оптики, касающихся природы, распространения и взаимодействия с веществом электромагнитного излучения оптического диапазона...
Медицинская энциклопедия
- методы исследования и оценки качества объектов кружающей среды с помощью органов чувств...
Медицинская энциклопедия
- общее название ряда методов импрегнации гистологических препаратов серебром для выявления глиальных и других аргирофильных волокон...
Медицинская энциклопедия
- назначаются следователем и судом для разрешения специальных вопросов, возникающих при расследовании преступлений и рассмотрении гражданских дел. Они проводятся также по предложению судебно-медицинских...
Медицинская энциклопедия

"Вирусологи́ческие ме́тоды иссле́дования" в книгах

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992)

автора Цалер Игорь

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Первый альбом лос-анджелесской группы Rage Against The Machine объединил хип-хоп и хард-рок, сдобрив их злободневными политическими манифестами и, что приятно, немалой дозой плотного фанкового ритма. В песне «Убивая во имя», вошедшей в первый сингл,

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970)

Из книги Популярная музыка XX века: джаз, блюз, рок, поп, кантри, фолк, электроника, соул автора Цалер Игорь

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970) К концу 1960-х годов Джеймс Браун взялся за эксперименты. Душераздирающий соул с группой The Famous Flames сменился тренькающим фанком с The J.B.’s. Одной из важнейших вех надвигающейся фанк-эпохи стала «Секс-машина», которая в десятиминутном варианте

Rage Against The Machine («Ярость Против Машин»)

Из книги Против невозможного (сборник статей о культуре) автора Колташов Василий Георгиевич

Rage Against The Machine («Ярость Против Машин») Том Морелло: «Наша цель - помочь людям освободиться от цепей лжи и насилия, которыми их опутали правительства, международные корпорации, масс-медиа и политические партии, дать людям во всем мире чувство уверенности в завтрашнем дне и

Welcome to the machine

Из книги Время колокольчиков автора Смирнов Илья

Welcome to the machine Начало перестройки в нашей истории мы можем датировать январем 1987-го года. Тогда состоялся либеральный Пленум ЦК, а мы получили возможность напечатать в «Юности» неотредактированный список современных «звезд» советского рока, включая ДДТ, ОБЛАЧНЫЙ КРАЙ и

Toyoda Machine Works

Из книги Гемба кайдзен. Путь к снижению затрат и повышению качества автора Имаи Масааки

Toyoda Machine Works По словам Ёсио Симы, директора Toyoda Machine Works, выгода от создания системы качества и стандартов для его обеспечения стала очевидной в 1980-е годы, когда компания, чтобы получить премию Деминга (Deming Prize), внедрила концепцию «всеобщего менеджмента на основе качества»

Машина (Machine)

Из книги Философский словарь автора Конт-Спонвиль Андре

Машина (Machine) «Если бы челноки ткали сами собой, – заметил однажды Аристотель, – ремесленникам не нужны были бы рабочие, а хозяевам – рабы» («Политика», I, 4). Это приблизительно и есть то, что мы называем машиной – способный двигаться предмет, лишенный души (автомат) и

Из книги Интернет-разведка [Руководство к действию] автора Ющук Евгений Леонидович

Архив сайтов Internet Archive Wayback Machine Электронный адрес – http://web.archive.org.Каждый, кто собирал информацию по интересующей его проблеме за достаточно длительный период, знает, как порой бывает важно найти сведения, опубликованные на сайте несколько лет назад. Иногда это просто

Архив сайтов Internet Archive Wayback Machine

Из книги Противодействие черному PR в Интернете автора Кузин Александр Владимирович

Архив сайтов Internet Archive Wayback Machine Очень часто нападение черных пиарщиков происходит неожиданно для вас. В таком случае вы впервые сталкиваетесь с необходимостью пристального изучения противника. В случае если вы даже предполагали подобное развитие событий (например, в

4.9. Резервное копирование с помощью Time Machine

автора Скрылина Софья

4.9. Резервное копирование с помощью Time Machine Операционная система Mac OS X Leopard позволяет выполнять регулярное резервное копирование данных на вашем компьютере с помощью приложения Time Machine (Машина времени). После соответствующих настроек приложение автоматически будет

4.9.2. Создание первой резервной копии с помощью Time Machine

Из книги Самоучитель работы на Macintosh автора Скрылина Софья

4.9.2. Создание первой резервной копии с помощью Time Machine Прежде чем перейти к созданию первой резервной копии, следует вставить внешний диск или иметь свободный раздел жесткого диска, отведенный только для резервного копирования.При подключении внешнего диска размером,

4.9.4. Использование Time Machine

Из книги Самоучитель работы на Macintosh автора Скрылина Софья

4.9.4. Использование Time Machine Когда необходимые настройки Time Machine выполнены и создано некоторое количество резервных копий, можно приступить к поиску и восстановлению ранних версий файлов. Для этого:1. Откройте окно Finder и выделите файл, необходимый для восстановления.2. Если

Вирусологический метод включает два основных этапа: выделение вирусов и их идентификацию. Материалами могут быть кровь, другие биологические и патологические жидкости, биоптаты органов и тканей.

Вирусологическое исследование крови часто проводят с целью диагностики арбовирусных инфекций. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа и других ОРВИ, кори. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеро-, адено-, рео- и ротавирусы.

Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности", например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, поэтому для выделения определенного вируса используют соответствующую культуру ткани. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментно заражать 3-4 культуры клеток, предполагая, что одна из них может оказаться чувствительной. Наличие вируса в зараженных культурах определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. цитопатогенному действию, обнаружению внутриклеточных включений, а также на основе выявления специфического антигена методом иммунофлюоресценции, положительных реакций гемадсорбции и гемагглютинации. Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Чаще всего используют эмбрионы кур. При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (арбовирусы), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.

Вирусы идентифицируют с помощью иммунологических методов: реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации, преципитации в геле, иммунофлюоресценции.

3.4 Биологический метод

Биологический метод состоит в заражении различным материалом (клиническим, лабораторным) лабораторных животных для индикации возбудителя, а также для определения некоторых свойств микроорганизмов, характеризующих их патогенность (токсигенность, токсичность, вирулентность). В качестве лабораторных животных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и др.

Воспроизведение заболевания у животного - абсолютное доказательство патогенности выделенного микроорганизма (в случае бешенства, столбняка и др.). Поэтому биологическая проба на животных является ценным и достоверным диагностическим методом, особенно при тех инфекциях, возбудители которых в исследуемых биологических средах организма человека содержатся в малых концентрациях и плохо или медленно растут на искусственных средах.

3.5 Иммунологический метод

Иммунологический метод (серологический) включает исследования сыворотки крови, а также других биологических субстратов для выявления специфических антител и антигенов. Классическая серодиагностика основана на определении антител к выявленному или предполагаемому возбудителю. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке крови антител к антигенам возбудителя, отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Обнаружения в исследуемой сыворотке крови антител к возбудителю ряда инфекционных болезней недостаточно для постановки диагноза, поскольку оно может отражать наличие постинфекционного или поствакцинального иммунитета, поэтому исследуют «парные» сыворотки крови, первую, взятую в первые дни болезни, и вторую, взятую с интервалом 7-10 дней. В этом случае оценивают динамику нарастания уровня антител.

Диагностически значимо увеличение титра антител в исследуемой сыворотке крови не менее чем в 4 раза относительно первоначального уровня. Этот феномен называют сероконверсией. При редких инфекционных болезнях, а также вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции и некоторых других факт наличия антител свидетельствует об инфицированности пациента и имеет диагностическое значение.

Кроме определения титра антител, при проведении серологических исследований можно установить изотип антител. Известно, что при первой встрече организма человека с возбудителем в остром периоде болезни выявляют более быстрое нарастание антител, принадлежащих к IgM, уровень которых, достигая максимального значения, затем снижается. В более поздние сроки болезни повышается количество IgG-антител, которые дольше сохраняются и определяются в периоде ре-конвалесценции. При повторной встрече с возбудителем благодаря иммунологической памяти реакции гуморального иммунитета проявляются более быстрой продукцией IgG-анти-тел, а антитела класса М вырабатываются в незначительном количестве. Обнаружение IgM-антител свидетельствует о наличии текущего инфекционного процесса, а наличие IgG-антител - о перенесенной в прошлом инфекции или поствакцинальном иммунитете.

Учитывая особенности первичного и вторичного иммунного ответа, анализ соотношения IgM- и IgG-антител позволяет в некоторых случаях дифференцировать стадию инфекционного процесса (разгар заболевания, реконвалесценция, рецидив). Например, в случае вирусного гепатита А (ГА) надежным методом диагностики служит определение анти-HAV IgM-антител в сыворотке крови. Их выявление свидетельствует о текущей или недавно возникшей HAV-инфекции.

Серологическое исследование для обнаружения антител при инфекционных заболеваниях является более доступным методом лабораторной диагностики, чем выделение возбудителя. Иногда положительная серологическая реакция служит единственным доказательством встречи и взаимодействия организма с возбудителем соответствующего инфекционного заболевания. Кроме того, ряд заболеваний со сходной клинической картиной (например, риккетсиозы, энтеровирусные инфекции) могут быть дифференцированы лишь серологически, что отражает значение серологических методов в диагностике инфекционных болезней.