Sai Nobeli preemia.

Meetodi kasutamise alguses, pärast iga kuumutamis-jahutustsüklit, tuli reaktsioonisegule lisada DNA polümeraas, kuna see inaktiveeriti kõrgel temperatuuril, mis oli vajalik DNA spiraali ahelate eraldamiseks. Reaktsiooniprotseduur oli suhteliselt ebaefektiivne, nõudes palju aega ja ensüümi. 1986. aastal täiustati oluliselt polümeraasi ahelreaktsiooni meetodit. On tehtud ettepanek kasutada termofiilsete bakterite DNA polümeraase. Need ensüümid osutusid termostabiilseks ja suutsid vastu pidada paljudele reaktsioonitsüklitele. Nende kasutamine võimaldas PCR-i lihtsustada ja automatiseerida. Bakteritest eraldati üks esimesi termostabiilseid DNA polümeraase Thermus aquaticus ja nimega Taq- polümeraas. Selle polümeraasi puuduseks on see, et eksliku nukleotiidi sisestamise tõenäosus on üsna suur, kuna sellel ensüümil puuduvad veaparandusmehhanismid (3" → 5" eksonukleaasi aktiivsus). Polümeraasid pfu Ja Pwo, mis on isoleeritud arheadest, omavad sellist mehhanismi, nende kasutamine vähendab oluliselt mutatsioonide arvu DNA-s, kuid nende töö kiirus (protsessivõime) on väiksem kui Taq. Praegu kasutatakse segusid Taq Ja pfu saavutada nii kõrge polümerisatsioonikiirus kui ka suur kopeerimistäpsus.

Meetodi leiutamise ajal töötas Cary Mullis sünteetilise keemikuna (ta sünteesis oligonukleotiide, mida seejärel kasutati punktmutatsioonide tuvastamiseks genoomse DNA-ga hübridiseerimise teel) ettevõttes Cetus Corporation, mis patenteeris PCR-meetodi. 1992. aastal müüs Cetus meetodi õigused ja kasutamise patendi Taq polümeraasi ettevõte Hoffman-La Roche 300 miljoni dollari eest. Siiski selgus, et Taq-polümeraasi iseloomustasid nõukogude biokeemikud A. Kaledin, A. Slyusarenko ja S. Gorodetsky 1980. aastal ning samuti 4 aastat enne seda nõukogude väljaannet, see tähendab 1976. aastal, Ameerika biokeemikud Alice Chien, David B. Edgar ja John M. Trela. Sellega seoses üritas ettevõte Promega (Promega) kohtus sundida Roche'i selle ensüümi ainuõigustest loobuma. Ameerika patent PCR-meetodile lõppes 2005. aasta märtsis.

PCR läbiviimine

Meetod põhineb teatud DNA piirkonna mitmekordsel selektiivsel kopeerimisel ensüümide abil tehistingimustes ( in vitro). Sel juhul kopeeritakse ainult määratud tingimustele vastav ala ja ainult siis, kui see on uuritavas valimis. Erinevalt DNA amplifikatsioonist elusorganismides (replikatsioonist) amplifitseeritakse PCR abil suhteliselt lühikesed DNA lõigud. Tavalises PCR protsessis ei ületa replitseeritud DNA piirkondade pikkus 3000 aluspaari (3 kbp). Erinevate polümeraaside segu abil, lisandite kasutamisel ja teatud tingimustel võib PCR fragmendi pikkus ulatuda 20-40 tuhande aluspaarini. See on siiski palju väiksem kui eukarüootse raku kromosomaalse DNA pikkus. Näiteks inimese genoom on umbes 3 miljardit aluspaari pikk.

Reaktsiooni komponendid

PCR jaoks on kõige lihtsamal juhul vaja järgmisi komponente:

• DNA matriit, mis sisaldab amplifitseerimist vajavat DNA osa.
• Kaks praimerit, mis on komplementaarne soovitud DNA fragmendi erinevate ahelate vastasotstega.
• termostabiilne DNA polümeraas on ensüüm, mis katalüüsib DNA polümerisatsiooni. PCR-is kasutatav polümeraas peab jääma kõrgel temperatuuril aktiivseks pikka aega, seetõttu kasutatakse termofiilidest eraldatud ensüüme - Thermus aquaticus(Taq polümeraas), Pyrococcus furiosus(Pfu polümeraas), Pyrococcus woesei(Pwo-polümeraas) ja teised.
• Deoksüribonukleosiidtrifosfaadid(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Polümeraasi tööks vajalikud Mg 2+ ioonid.
• puhverlahus, tagades vajalikud reaktsioonitingimused - pH, lahuse ioontugevus. Sisaldab sooli, veise seerumi albumiini.

Et vältida reaktsioonisegu aurustumist, lisatakse katseklaasi kõrge keemistemperatuuriga õli, näiteks vaseliin. Kui kasutatakse soojendusega kaanetsüklit, pole see vajalik.

Pürofosfataasi lisamine võib suurendada PCR reaktsiooni saagist. See ensüüm katalüüsib kasvavale DNA ahelale nukleotiidtrifosfaatide lisamisel tekkiva pürofosfaadi hüdrolüüsi ortofosfaadiks. Pürofosfaat võib inhibeerida PCR reaktsiooni.

Praimerid

PCR spetsiifilisus põhineb komplementaarsete komplekside moodustumisel matriitsi ja praimerite vahel, lühikesed sünteetilised oligonukleotiidid pikkusega 18-30 alust. Iga praimer on komplementaarne kaheahelalise matriitsi ühe ahelaga ja piirab amplifitseeritud piirkonna algust ja lõppu.

Pärast matriitsi hübridiseerimist praimeriga (anniilimine) toimib viimane DNA polümeraasi praimerina matriitsi komplementaarse ahela sünteesil (vt.).

Praimerite kõige olulisem omadus on praimer-maatriksi kompleksi sulamistemperatuur (Tm).

T m on temperatuur, mille juures pooled DNA matriitsidest moodustavad kompleksi oligonukleotiidpraimeriga. Lühikese oligonukleotiidi (ja pikkade DNA fragmentide) T m arvutamise keskmine valem, võttes arvesse K + ioonide ja DMSO kontsentratsiooni:

kus L on nukleotiidide arv praimeris, K + on kaaliumiioonide molaarne kontsentratsioon, G+C on kõigi guaniinide ja tsütosiinide summa.

Kui praimeri pikkus ja nukleotiidide koostis või anniilimistemperatuur on valesti valitud, on võimalik osaliselt komplementaarsete komplekside moodustumine teiste matriitsi DNA piirkondadega, mis võib viia mittespetsiifiliste produktide ilmnemiseni. Sulamistemperatuuri ülempiiri piirab polümeraasi optimaalne toimetemperatuur, mille aktiivsus langeb temperatuuril üle 80 °C.

Kruntvärvide valimisel on soovitav järgida järgmisi kriteeriume:

võimendi

Riis. üks: PCR tsükkel

PCR viiakse läbi võimendis - seadmes, mis tagab katseklaaside perioodilise jahutamise ja kuumutamise, tavaliselt täpsusega vähemalt 0,1 ° C. Kaasaegsed tsikliseadmed võimaldavad seadistada keerulisi programme, sealhulgas "kuumkäivituse", Touchdown PCR-i (vt allpool) ja hilisemat amplifitseeritud molekulide säilitamist 4 °C juures. Reaalajas PCR jaoks toodetakse fluorestsentsdetektoriga varustatud seadmeid. Instrumendid on saadaval ka automaatse kaane ja mikroplaadi kambriga, mis võimaldab neid integreerida automatiseeritud süsteemidesse.

Reaktsiooni edenemine

Foto geelist, mis sisaldab marker-DNA-d (esimene ja viimane pilu) ja PCR tooteid

Tavaliselt tehakse PCR-i käigus 20-35 tsüklit, millest igaüks koosneb kolmest etapist (joonis 2).

Denatureerimine

Kaheahelalist DNA matriitsi kuumutatakse temperatuuril 94–96 °C (või 98 °C, kui kasutatakse eriti termostabiilset polümeraasi) 0,5–2 minutiks, et võimaldada DNA ahelate eraldumist. Seda etappi nimetatakse denatureerimine sest vesiniksidemed kahe DNA ahela vahel on katkenud. Mõnikord enne esimest tsüklit (enne polümeraasi lisamist) reaktsioonisegu eelkuumutatakse 2–3 minutit, et matriit ja praimerid täielikult denatureerida. Sellist lähenemist nimetatakse kuum start, see võimaldab vähendada mittespetsiifiliste reaktsiooniproduktide hulka.

Lõõmutamine

Kui kiud on eraldatud, alandatakse temperatuuri, et praimerid saaksid seonduda üheahelalise malliga. Seda etappi nimetatakse lõõmutamine. Anniilimistemperatuur sõltub praimerite koostisest ja valitakse tavaliselt võrdseks praimerite sulamistemperatuuriga. Anniilimistemperatuuri vale valik põhjustab kas praimerite halva seondumise malliga (kõrgendatud temperatuuril) või vales kohas seondumise ja mittespetsiifiliste saaduste ilmumise (madalal temperatuuril). Lõõmutamisetapi aeg on 30 sek, samal ajal jõuab polümeraas selle aja jooksul juba mitusada nukleotiidi sünteesida. Seetõttu on soovitatav valida praimerid sulamistemperatuuriga üle 60 °C ning läbi viia lõõmutamine ja venitamine samaaegselt, temperatuuril 60-72 °C.

Pikendamine

DNA polümeraas replitseerib matriitsi ahelat, kasutades praimerit praimerina. See on lava pikenemine. Polümeraas alustab teise ahela sünteesi malliga seondunud praimeri 3" otsast ja liigub piki malli, sünteesides uue ahela suunas 5" kuni 3" otsa. 72 °C. Elongatsiooniaeg sõltub nii DNA polümeraasi tüübist kui ka amplifitseeritud fragmendi pikkusest.Tavaliselt võetakse pikenemisajaks üks minut iga tuhande aluspaari kohta.Peale kõiki tsükleid tehakse sageli lisaetapp. lõplik pikenemine et lõpetada kõik üheahelalised killud. See etapp kestab 7-10 minutit.

Riis. 2: esimese PCR-tsükli skemaatiline esitus. (1) Denatureerimine 94-96 °C juures. (2) Lõõmutamine 68 °C juures (näiteks). (3) Pikendamine 72 °C juures (P = polümeraas). (4) Esimene tsükkel on lõppenud. Kaks saadud DNA ahelat toimivad järgmise tsükli matriitsina, seega kahekordistub matriitsi DNA kogus iga tsükli jooksul.

Konkreetse reaktsioonisaaduse kogus (piiratud praimeritega) suureneb teoreetiliselt proportsionaalselt 2n - 2n, kus n on reaktsioonitsüklite arv. Tegelikult võib iga tsükli kasutegur olla alla 100%, seega tegelikkuses P ~ (1+E) n , kus P on produkti kogus, E on tsükli keskmine efektiivsus.

Kasvab ka "pikkade" DNA koopiate arv, kuid lineaarselt, seega domineerib reaktsiooniproduktides konkreetne fragment.

Vajaliku produkti kasvu piiravad eksponentsiaalselt reaktiivide hulk, inhibiitorite olemasolu ja kõrvalsaaduste teke. Reaktsiooni viimastel tsüklitel kasv aeglustub, seda nimetatakse "platooefektiks".

PCR-i sordid

• Pesastatud PCR(Pesastatud PCR (eng.) ) – kasutatakse reaktsiooni kõrvalsaaduste arvu vähendamiseks. Kasutage kahte paari praimereid ja viige läbi kaks järjestikust reaktsiooni. Teine praimerite paar võimendab DNA piirkonda esimese reaktsiooni produktis.
• Pööratud PCR(Inverse PCR (inglise) ) - kasutatakse juhul, kui soovitud järjestuses on teada vaid väike ala. See meetod on eriti kasulik, kui on vaja määrata naaberjärjestused pärast DNA sisestamist genoomi. Pööratud PCR rakendamiseks tehakse restriktsiooniensüümidega DNA lõikamine, millele järgneb fragmentide ühendamine (ligeerimine). Selle tulemusena on teadaolevad fragmendid tundmatu piirkonna mõlemas otsas, misjärel saab tavapäraselt läbi viia PCR.
• pöördtranskriptsiooni PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (inglise) ) – kasutatakse teadaoleva järjestuse amplifitseerimiseks, isoleerimiseks või tuvastamiseks RNA raamatukogust. Enne tavapärast PCR-i sünteesitakse mRNA matriitsil reversetaasi abil üheahelaline DNA molekul ja saadakse üheahelaline cDNA, mida kasutatakse PCR matriitsina. See meetod määrab sageli kindlaks, kus ja millal need geenid ekspresseeritakse.
• Asümmeetriline PCR(Inglise) Asümmeetriline PCR) - viiakse läbi, kui on vaja amplifitseerida peamiselt ühte algse DNA ahelatest. Kasutatakse mõnes sekveneerimis- ja hübridisatsioonianalüüsi tehnikas. PCR viiakse läbi nagu tavaliselt, välja arvatud see, et ühte praimerit võetakse suures liias. Selle meetodi modifikatsioonid on inglise keeles. L sisemine- A pärast- T ta- E xponential-PCR (LATE-PCR), mis kasutab erineva kontsentratsiooniga praimereid ja madala kontsentratsiooniga praimer valitakse kõrgema (sulamistemperatuuriga) kui kõrge kontsentratsiooniga praimer. PCR viiakse läbi kõrgel anniilimistemperatuuril, säilitades seeläbi reaktsiooni efektiivsuse kõigi tsüklite jooksul.
• Kvantitatiivne PCR(Kvantitatiivne PCR, Q-PCR) või reaalajas PCR- kasutatakse konkreetse PCR produkti koguse mõõtmise otseseks jälgimiseks igas reaktsioonitsüklis. See meetod kasutab fluorestseeruvalt märgistatud praimereid või DNA sonde, et mõõta täpselt reaktsioonisaaduse kogust selle akumuleerumisel; või kasutatakse fluorestseeruvat interkalatsioonivärvi Sybr Green I mis seostub kaheahelalise DNA-ga. Sybr Green I pakub lihtsat ja kulutõhusat võimalust PCR-i toodete reaalajas tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks, ilma et oleks vaja spetsiifilisi fluorestsentssonde või praimereid. Võimendamise ajal värvaine SYBR Roheline I integreerub PCR-produktide DNA väiksemasse soonde ja kiirgab sinise laseriga kiiritades tugevamat fluorestsentssignaali kui seondumata värvaine. SYBR Roheline Iühildub kõigi praegu teadaolevate reaalajas PCR-seadmetega. Maksimaalne imendumine SYBR Roheline I on lainepikkusel 494 nm. Lisaks põhilisele on värvaine spektris kaks väikest täiendavat neeldumismaksimumit - 290 nm ja 380 nm juures. Maksimaalne emissioon SYBR Roheline I on lainepikkusel 521 nm (roheline).
• Etapp PCR(Touchdown PCR (inglise) ) – seda lähenemist kasutades väheneb praimerite mittespetsiifilise seondumise mõju. Esimesed tsüklid viiakse läbi temperatuuril, mis on kõrgem optimaalsest lõõmutamistemperatuurist, seejärel alandatakse iga paari tsükli järel lõõmutamistemperatuuri järk-järgult optimaalseks. Selle eesmärk on tagada, et praimer hübridiseerub komplementaarse ahelaga kogu selle pikkuses; samas kui optimaalsel anniilimistemperatuuril hübridiseerub praimer osaliselt komplementaarse ahelaga. Praimeri osaline hübridisatsioon genoomsel DNA-l viib mittespetsiifilise amplifikatsioonini, kui praimeri jaoks on piisavalt seondumiskohti. Enamikul juhtudel saab esimesed kümme PCR-tsüklit läbi viia anniilimistemperatuuril 72–75 °C ja seejärel kohe alandada optimaalsele, näiteks 60–65 °C-le.
• Molekulaarse koloonia meetod(PCR geelis) Koloonia-PCR koloonia) - akrüülamiidgeel polümeriseeritakse kõigi PCR komponentidega pinnal ja viiakse läbi PCR. Analüüsitud DNA-d sisaldavates punktides toimub amplifikatsioon koos molekulaarsete kolooniate moodustumisega.
• PCR cDNA otste kiire amplifikatsiooniga(Inglise) cDNA otste kiire amplifikatsioon, RACE-PCR ).
• Pikkade fragmentide PCR(Inglise) Pikamaa PCR) - PCR-i modifitseerimine laiendatud DNA segmentide (10 tuhat või enam alust) amplifitseerimiseks. Kasutatakse kahe polümeraasi segu, millest üks on suure protsessiivsusega Taq polümeraas (see tähendab, et see on võimeline sünteesima pika DNA ahela ühe käiguga) ja teine ​​on DNA polümeraas, millel on 3 "-5" eksonukleaasi aktiivsust. tavaliselt Pfu polümeraas. Teine polümeraas on vajalik esimesega tekitatud vigade parandamiseks, kuna Taq polümeraas peatab DNA sünteesi, kui on lisatud mittekomplementaarne nukleotiid. See mittekomplementaarne nukleotiid eemaldatakse Pfu polümeraasiga. Polümeraaside segu võetakse vahekorras 50:1 või isegi alla 100:1, kusjuures Taq polümeraasi võetakse 25-100 korda rohkem kui Pfu polümeraasi.
• RAPD(Inglise) Polümorfse DNA juhuslik amplifikatsioon ), PCR polümorfse DNA juhusliku amplifikatsiooniga – kasutatakse siis, kui on vaja eristada geenijärjestuselt lähedasi organisme, näiteks erinevaid kultuurtaimede sorte, koeratõuge või lähedalt seotud mikroorganisme. See meetod kasutab tavaliselt ühte väikest praimerit (umbes 10 aluspaari). See praimer on osaliselt komplementaarne uuritavate organismide juhuslike DNA piirkondadega. Valides tingimusi (praimeri pikkus, praimeri koostis, temperatuur jne), on võimalik saavutada kahe organismi puhul rahuldav erinevus PCR mustris.
• Grupispetsiifiline PCR(Inglise) rühmaspetsiifiline PCR) – PCR seotud järjestuste jaoks samades või erinevate liikide vahel, kasutades nende järjestuste konservatiivseid praimereid. Näiteks ribosoomi universaalsete praimerite valik 18S Ja 26S geenid liigispetsiifilise intergeenidevahelise speisseri võimendamiseks: geenijärjestus 18S Ja 26S on liikidevaheline konservatiivne, seega toimub nende geenide vaheline PCR kõigi uuritud liikide puhul. Selle meetodi vastand on ainulaadne PCR(Inglise) ainulaadne PCR), mille ülesandeks on valida praimerid, et amplifitseerida ainult teatud järjestust seotud järjestuste hulgast.
• PCR kuumkäivituse abil(Inglise) Kuumkäivituse PCR) - PCR modifikatsioon DNA polümeraasi abil, mille puhul polümeraasi aktiivsus blokeeritakse toatemperatuuril antikehade või väikeste molekulidega, mis jäljendavad antikehi nagu Affibody, st reaktsiooni ajal enne esimest denatureerimist PCR-is. Tavaliselt viiakse esimene denatureerimine läbi 95 °C juures 10 minutit.
• Virtuaalne PCR(ing. in silico PCR, digitaalne PCR, elektrooniline PCR, e-PCR) - matemaatiline meetod teoreetilise polümeraasi ahelreaktsiooni arvutianalüüsiks, kasutades praimerjärjestuste (või DNA-sondide) loendit, et ennustada uuritava genoomi potentsiaalset DNA amplifikatsiooni. , kromosoom, ringikujuline DNA või mõni muu DNA tükk.

Kui matriitsi nukleotiidjärjestus on osaliselt teada või üldse teadmata, võib kasutada degenereerunud praimerid, mille jada sisaldab degenereerunud positsioone, mis võivad sisaldada mis tahes aluseid. Näiteks võib praimeri järjestus olla järgmine: …ATH…, kus N - A, T või C.

PCR rakendamine

PCR-i kasutatakse paljudes valdkondades analüüsiks ja teaduslikes katsetes.

Kriminalistika

PCR-i kasutatakse niinimetatud "geneetiliste sõrmejälgede" võrdlemiseks. Vaja on kuriteopaiga geneetilise materjali proovi – veri, sülg, sperma, juuksed jne. Seda võrreldakse kahtlustatava geneetilise materjaliga. Piisab väga väikesest kogusest DNA-st, teoreetiliselt – ühest koopiast. DNA lõigatakse fragmentideks, seejärel amplifitseeritakse PCR abil. Fragmendid eraldatakse DNA elektroforeesiga. Saadud pilti DNA ribade paigutusest nimetatakse geneetiline sõrmejälg(Inglise) geneetiline sõrmejälg).

Isaduse tuvastamine

Riis. 3: PCR-ga amplifitseeritud DNA fragmentide elektroforeesi tulemused. (1) Isa. (2) Laps. (3) Ema. Laps päris mõlema vanema geneetilise jälje mõned tunnused, mis andis uue, kordumatu jälje.

Kuigi "geneetilised sõrmejäljed" on ainulaadsed (v.a identsete kaksikute puhul), saab perekondlikke sidemeid siiski luua mitme sellise sõrmejälje tegemisega (joonis 3). Sama meetodit saab väikeste muudatustega rakendada organismide vaheliste evolutsiooniliste suhete tuvastamiseks.

Meditsiiniline diagnostika

PCR võimaldab oluliselt kiirendada ja hõlbustada pärilike ja viirushaiguste diagnoosimist. Soovitud geen amplifitseeritakse PCR abil, kasutades sobivaid praimereid, ja seejärel sekveneeritakse mutatsioonide määramiseks. Viirusnakkusi saab avastada kohe pärast nakatumist, nädalaid või kuid enne haiguse sümptomite ilmnemist.

Personaliseeritud meditsiin

Mõnikord on ravimid mõne patsiendi jaoks mürgised või allergeensed. Selle põhjuseks on osaliselt individuaalsed erinevused ravimite ja nende derivaatide tundlikkuses ja metabolismis. Need erinevused on määratud geneetilisel tasandil. Näiteks võib ühel patsiendil teatud tsütokroom (võõrainete metabolismi eest vastutav maksavalk) olla aktiivsem, teisel - vähem. Selleks, et teha kindlaks, millist tüüpi tsütokroom konkreetsel patsiendil on, on soovitatav enne ravimi kasutamist läbi viia PCR-analüüs. Seda analüüsi nimetatakse esialgseks genotüpiseerimiseks. tulevane genotüpiseerimine).

Geenide kloonimine

Geenide kloonimine (mitte segi ajada organismide kloonimisega) on geenide isoleerimise ja geenitehnoloogia manipulatsioonide tulemusena suure koguse antud geeni produkti saamine. PCR-i kasutatakse geeni amplifitseerimiseks, mis seejärel sisestatakse vektor- DNA fragment, mis kannab võõra geeni samasse või mõnda teise kasvatamiseks sobivasse organismi. Vektoritena kasutatakse näiteks plasmiide ​​või viiruse DNA-d. Tavaliselt kasutatakse geenide sisestamist võõrorganismi selle geeni produkti - RNA või kõige sagedamini valgu saamiseks. Seega saadakse palju valke tööstuslikes kogustes kasutamiseks põllumajanduses, meditsiinis jne.

Riis. 4: Geeni kloonimine plasmiidi abil.
(1) Organismi A kromosomaalne DNA. (2) PCR. (3) Organismi A geeni mitu koopiat. (4) Geeni sisestamine plasmiidi. (5) Plasmiid organismi A geeniga. (6) Plasmiidi sisestamine organismi B. (7) Organismi A geeni koopiaarvu paljundamine organismis B.

DNA sekveneerimine

Fluorestseeruva märgise või radioaktiivse isotoobiga märgistatud dideoksünukleotiide kasutavas sekveneerimismeetodis on PCR lahutamatu osa, kuna just polümerisatsiooni käigus sisestatakse DNA ahelasse fluorestseeruva või radioaktiivse märgisega märgistatud nukleotiidide derivaadid. Dideoksünukleotiidi lisamine sünteesitud ahelale lõpetab sünteesi, võimaldades pärast geelis eraldamist määrata spetsiifiliste nukleotiidide asukohta.

Mutagenees

Praegu on PCR muutunud peamiseks mutageneesi läbiviimise meetodiks (muutuste sisseviimine DNA nukleotiidjärjestuses). PCR kasutamine võimaldas mutageneesi protseduuri lihtsustada ja kiirendada, samuti muuta see usaldusväärsemaks ja reprodutseeritavamaks.

Paljude nakkushaiguste piisavaks ja tõhusaks raviks on vaja õigeaegselt määrata täpne diagnoos. Selle probleemi lahendamisel on tänapäeval kaasatud kõrgtehnoloogilised molekulaarbioloogia meetoditel põhinevad diagnostikameetodid. Praegu kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) juba laialdaselt praktilises meditsiinis kui kõige usaldusväärsemat laboratoorset diagnostikavahendit.

Mis seletab PCR-i populaarsust praegusel ajal?

Esiteks kasutatakse seda meetodit erinevate nakkushaiguste patogeenide suure täpsusega tuvastamiseks.

Teiseks jälgida ravi efektiivsust.

Erinevates käsiraamatutes, prospektides, artiklites, aga ka eriarstide selgitustes kohtame sageli arusaamatute terminite ja sõnade kasutamist. Kõrgtehnoloogilistest teaduse toodetest on tõesti raske tavaliste sõnadega rääkida.

Mis on PCR-diagnostika olemus ja mehaanika?

Igal elusorganismil on oma ainulaadsed geenid. Geenid asuvad DNA molekulis, mis on tegelikult iga konkreetse organismi "visiitkaart". DNA (geneetiline materjal) on väga pikk molekul, mis koosneb ehitusplokkidest, mida nimetatakse nukleotiidideks. Iga nakkushaiguste patogeeni jaoks paiknevad need rangelt spetsiifiliselt, st teatud järjestuses ja kombinatsioonis. Kui on vaja aru saada, kas inimesel on konkreetne haigusetekitaja, võetakse bioloogiline materjal (veri, uriin, sülg, määrdumine), mis sisaldab mikroobi DNA-d või DNA fragmente. Kuid patogeeni geneetilise materjali hulk on väga väike ja on võimatu öelda, millisesse mikroorganismisse see kuulub. Selle probleemi lahendamiseks kasutatakse PCR-i. Polümeraasi ahelreaktsiooni olemus seisneb selles, et uurimiseks võetakse vähe DNA-d sisaldavat materjali ning PCR protsessi käigus suureneb konkreetsele patogeenile kuuluva geneetilise materjali hulk ning seeläbi on võimalik seda tuvastada.

PCR diagnostika on biomaterjali geneetiline uuring.

PCR-meetodi idee kuulub Ameerika teadlasele K. Mullinsile, mille ta pakkus välja 1983. aastal. Laialdast kliinilist kasutamist sai see aga alles XX sajandi 90ndate keskel.

Tegeleme terminoloogiaga, mis see on - DNA jne. Iga elusolendi (loom, taim, inimene, bakter, viirus) rakul on kromosoomid. Kromosoomid on geneetilise teabe hoidjad, mis sisaldavad iga konkreetse elusolendi kogu geenide järjestust.

Iga kromosoom koosneb kahest DNA ahelast, mis on üksteise suhtes keerdunud spiraaliks. DNA on keemiliselt desoksüribonukleiinhape, mis koosneb struktuurikomponentidest – nukleotiididest. Nukleotiide on 5 tüüpi – tümiin (T), adenosiin (A), guaniin (G), tsütosiin (C) ja uratsiil (U). Nukleotiidid paiknevad üksteise järel ranges individuaalses järjestuses, moodustades geene. Üks geen võib koosneda 20-200 sellisest nukleotiidist. Näiteks insuliini tootmist kodeeriv geen on 60 aluspaari pikkune.

Nukleotiididel on komplementaarsuse omadus. See tähendab, et DNA ühes ahelas on adeniin (A) alati teises ahelas tümiin (T) ja guaniin (G) vastas - tsütosiin (C). Skemaatiliselt näeb välja selline:
G-C
T-A
A-T
See komplementaarsuse omadus on PCR jaoks võtmetähtsusega.

Lisaks DNA-le on RNA-l sama struktuur – ribonukleiinhape, mis erineb DNA-st selle poolest, et kasutab tümiini asemel uratsiili. RNA - on geneetilise teabe hoidja mõnedes viirustes, mida nimetatakse retroviirusteks (näiteks HIV).

DNA ja RNA molekulid võivad "paljuneda" (seda omadust kasutatakse PCR jaoks). See juhtub järgmiselt: kaks DNA või RNA ahelat eemalduvad teineteisest külgedele, igal niidil istub spetsiaalne ensüüm, mis sünteesib uue ahela. Süntees toimub komplementaarsuse põhimõttel, see tähendab, et kui nukleotiid A on algses DNA ahelas, siis T on äsja sünteesitud ahelas, kui G - siis C jne. See eriline "ehitaja" ensüüm vajab sünteesi alustamiseks "seemnet" - 5-15 nukleotiidist koosnevat järjestust. See "seeme" on määratletud iga geeni jaoks (klamüüdia geen, mükoplasma, viirused) katseliselt.

Seega koosneb iga PCR-tsükkel kolmest etapist. Esimeses etapis toimub DNA nn lahtikerimine – see tähendab kahe omavahel ühendatud DNA ahela eraldumine. Teises on "seeme" kinnitatud DNA ahela osa külge. Ja lõpuks nende DNA ahelate pikenemine, mida toodab "ehitaja" ensüüm. Praegu toimub kogu see keeruline protsess ühes katseklaasis ja koosneb korduvatest DNA reprodutseerimise tsüklitest, mida määratakse, et saada suur hulk koopiaid, mida saab seejärel tuvastada tavapäraste meetoditega. See tähendab, et ühest DNA ahelast saame sadu või tuhandeid.

PCR-uuringu etapid

Bioloogilise materjali kogumine uurimistööks

Proovina kasutatakse erinevaid bioloogilisi materjale: veri ja selle komponendid, uriin, sülg, limaskestade eritised, tserebrospinaalvedelik, eritis haavapindadest, kehaõõnsuste sisu. Kõik bioproovid kogutakse ühekordselt kasutatavate instrumentidega ja kogutud materjal asetatakse steriilsetesse plasttorudesse või asetatakse söötmele, millele järgneb transport laborisse.

Võetud proovidele lisatakse vajalikud reaktiivid ja asetatakse programmeeritavasse termostaati - termotsüklerisse (võimendisse). Tsükleris korratakse PCR-i tsüklit 30-50 korda, mis koosneb kolmest etapist (denatureerimine, lõõmutamine ja elongatsioon). Mida see tähendab? Vaatleme üksikasjalikumalt.

Vahetu PCR reaktsiooni etapid, geneetilise materjali kopeerimine

maPCR etapp – geneetilise materjali ettevalmistamine kopeerimiseks.
Tekib temperatuuril 95 ° C, samal ajal kui DNA ahelad on lahti ühendatud ja "seemned" võivad neile istuda.

"Seemneid" toodavad tööstuslikult erinevad teadus- ja tootmisühingud ning laborid ostavad valmis. Samas näiteks klamüüdia tuvastamise “seeme” töötab ainult klamüüdia jne puhul. Seega, kui biomaterjali testitakse klamüüdia infektsiooni esinemise suhtes, asetatakse reaktsioonisegusse klamüüdia "seeme"; kui testitakse biomaterjali Epstein-Barri viiruse suhtes, siis Epstein-Barri viiruse "seeme".

IIetapp – nakkustekitaja ja "seemne" geneetilise materjali ühendamine.
Kui on vaja määrata viiruse või bakteri DNA-d, asub "seeme" sellel DNA-l. See praimeri lisamise protsess on PCR-i teine ​​etapp. See etapp toimub temperatuuril 75 °C.

IIIetapp – nakkustekitaja geneetilise materjali kopeerimine.
See on geneetilise materjali tegelik pikenemise või paljunemise protsess, mis toimub 72 °C juures. Ensüümiehitaja läheneb "seemnetele" ja sünteesib uue DNA ahela. Uue DNA ahela sünteesi lõppedes lõpeb ka PCR tsükkel. See tähendab, et ühes PCR-tsüklis kahekordistub geneetilise materjali hulk. Näiteks esialgses proovis oli 100 viiruse DNA molekuli, pärast esimest PCR tsüklit on proovis juba 200 testitava viiruse DNA molekuli. Üks tsükkel kestab 2-3 minutit.

Selleks, et genereerida identifitseerimiseks piisavalt geneetilist materjali, tehakse tavaliselt 30-50 PCR tsüklit, mis võtab aega 2-3 tundi.

Paljundatud geneetilise materjali tuvastamise etapp

PCR ise lõpeb siin ja siis tuleb sama oluline identifitseerimise etapp. Identifitseerimiseks kasutatakse elektroforeesi või märgistatud "seemneid". Elektroforeesi kasutamisel eraldatakse saadud DNA ahelad suuruse järgi ja erineva pikkusega DNA fragmentide olemasolu näitab analüüsi positiivset tulemust (see tähendab konkreetse viiruse, bakteri jne olemasolu). Märgistatud "seemnete" kasutamisel lisatakse reaktsiooni lõpp-produktile kromogeen (värv), mille tulemusena kaasneb ensümaatilise reaktsiooniga värvuse teke. Värvuse tekkimine näitab otseselt, et algproovis on viirus või mõni muu tuvastatav aine.

Tänapäeval on võimalik märgistatud "seemneid" ja ka vastavat tarkvara kasutades PCR tulemusi kohe "lugeda". See on nn reaalajas PCR.

Miks on PCR-diagnostika nii väärtuslik?

PCR-meetodi üks olulisi eeliseid on selle kõrge tundlikkus - 95-100%. Need eelised peavad aga põhinema järgmiste tingimuste vältimatul järgimisel:

1. õige proovide võtmine, bioloogilise materjali transport;
2. steriilsete, ühekordselt kasutatavate instrumentide, spetsiaalsete laborite ja koolitatud personali kättesaadavus;
3. metoodika ja steriilsuse range järgimine analüüsi ajal

Tundlikkus on erinevate tuvastatud mikroobide puhul erinev. Nii on näiteks C-hepatiidi viiruse tuvastamise PCR-meetodi tundlikkus 97–98%, ureaplasma tuvastamise tundlikkus on 99–100%.

PCR analüüsile omased võimalused võimaldavad teil saavutada ületamatu analüütilise spetsiifilisuse. See tähendab, et tuvastatakse täpselt see mikroorganism, mida otsiti, mitte aga sarnane või lähedalt seotud.
PCR-meetodi diagnostiline tundlikkus ja spetsiifilisus ületab sageli kultiveerimismeetodi omad, mida nimetatakse nakkushaiguste tuvastamise "kuldstandardiks". Arvestades kultuuri kasvu kestust (mitu päeva kuni mitu nädalat), ilmneb PCR-meetodi eelis.

PCR infektsioonide diagnoosimisel
PCR-meetodi eelised (tundlikkus ja spetsiifilisus) määravad tänapäeva meditsiinis laia kasutusala.
PCR-diagnostika peamised rakendusvaldkonnad:

1. erineva lokaliseerimisega ägedate ja krooniliste nakkushaiguste diagnoosimine
2. ravi efektiivsuse jälgimine
3. patogeeni tüübi selgitamine

PCR-i kasutatakse sünnitusabis, günekoloogias, neonatoloogias, pediaatrias, uroloogias, venereoloogias, nefroloogias, nakkushaiguste kliinikus, oftalmoloogias, neuroloogias, ftisiopulmonoloogias jne.

PCR-diagnostika kasutamine toimub koos teiste uurimismeetoditega (ELISA, PIF, RIF jne). Nende kombinatsiooni ja otstarbekuse määrab raviarst.

PCR-iga tuvastatud nakkusetekitajad

Viirused:

1. HIV-1 ja HIV-2 retroviirused
2. herpetiformsed viirused
3. 1. ja 2. tüüpi herpes simplex viirus

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)- molekulaarbioloogia eksperimentaalne meetod, mis on sünteetiliste oligonukleotiidpraimerite poolt indutseeritud nukleiinhapete spetsiifiline amplifikatsioon in vitro.

PCR-meetodi väljatöötamise idee kuulub Ameerika teadlasele Kary Mullisele, kes lõi 1983. aastal meetodi, mis võimaldas kunstlikes tingimustes DNA polümeraasi ensüümi abil tsükliliste kahekordistumise käigus DNA-d amplifitseerida. Mõni aasta pärast selle idee avaldamist, 1993. aastal, sai K. Mullis selle eest Nobeli preemia.

Meetodi kasutamise alguses, pärast iga kuumutamis-jahutustsüklit, oli vaja reaktsioonisegule lisada DNA polümeraas, kuna see inaktiveerus kõrgel temperatuuril kiiresti. Protseduur oli väga ebaefektiivne, nõudes palju aega ja ensüümi. 1986. aastal muudeti seda oluliselt termofiilsete bakterite DNA polümeraasi abil. Need ensüümid taluvad paljusid reaktsioonitsükleid, mis võimaldab PCR-i automatiseerida. Bakteritest on eraldatud üks kõige sagedamini kasutatavaid termostabiilseid DNA polümeraase. Thermus aquaticus ja nimega Taq-DNA polümeraas.

Meetodi olemus. Meetod põhineb teatud DNA piirkonna mitmekordsel selektiivsel kopeerimisel ensüümi Taq-DNA polümeraasi abil. Polümeraasi ahelreaktsioon võimaldab saada kuni mitme tuhande aluspaari pikkuseid amplifikaate. PCR-produkti pikkuse suurendamiseks 20-40 tuhande aluspaarini kasutatakse erinevate polümeraaside segu, kuid see on siiski palju väiksem kui eukarüootse raku kromosomaalse DNA pikkus.

Reaktsioon viiakse läbi programmeeritavas termostaadis (võimendis) - seadmes, mis suudab piisavalt kiiresti läbi viia

katseklaaside jahutamine ja soojendamine (tavaliselt täpsusega vähemalt 0,1 °C). Võimendid võimaldavad teil seadistada keerukaid programme, sealhulgas neid, millel on "kuumkäivituse" ja sellele järgneva salvestusvõimalusega programm. Reaalajas PCR jaoks toodetakse fluorestsentsdetektoriga varustatud seadmeid. Instrumendid on saadaval ka automaatse kaane ja mikroplaadi kambriga, mis võimaldab neid integreerida automatiseeritud süsteemidesse.

Tavaliselt tehakse PCR-i käigus 20-45 tsüklit, millest igaüks koosneb kolmest etapist: denatureerimine, praimeri anniilimine, elongatsioon (joonis 6.1 ja 6.2). Joonisel fig. 6.1 näitab katseklaasi temperatuurimuutuste dünaamikat PCR tsükli ajal.

Riis. 6.1. Temperatuuri muutuse graafik katseklaasis ühe polümeraasi ahelreaktsiooni tsükli jooksul

DNA matriitsi denatureerimine Kuumutatakse reaktsioonisegu temperatuurini 94–96 °C 5–90 sekundiks, nii et DNA ahelad hajuvad. Tuleb märkida, et enne esimest tsüklit eelkuumutatakse reaktsioonisegu 2–5 minutit, et denatureerida täielikult algmaatriks, mis võimaldab vähendada mittespetsiifiliste reaktsioonisaaduste hulka.

Riis. 6.2. Polümeraasi ahelreaktsiooni esimese tsükli skeem

Praimeri lõõmutamise etapp. Temperatuuri järkjärgulise langusega seonduvad praimerid matriitsiga komplementaarselt. Lõõmutamistemperatuur sõltub praimerite koostisest ja on tavaliselt 4-5°C madalam kui arvutatud sulamistemperatuur. Etapi kestvus 5-60 s.

Järgmise etapi jooksul - pikenemine- emamaatriksil toimub DNA tütarahela süntees. Pikendustemperatuur sõltub polümeraasist. Tavaliselt kasutatavad Taq ja Pfu DNA polümeraasid on kõige aktiivsemad 72 °C juures. Pikendusaeg, mis sõltub peamiselt PCR-produkti pikkusest, on tavaliselt 1 minut 1000 aluspaari kohta.

MEETODI PÕHIMÕTE (molekulaarbioloogiline alus)

Paljude DNA analüüsi hübridiseerimismeetodite hulgast kasutatakse kliinilises laboridiagnostikas kõige laialdasemalt PCR-i.

Meetodi põhimõte polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)(Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)) töötas välja Cary Mullis (Cetus, USA) 1983. aastal. ning on praegu laialdaselt kasutusel nii teadusuuringuteks kui ka diagnostikaks praktilises tervishoius ja riiklikus sanitaar- ja epidemioloogilises järelevalveteenistuses (genotüpiseerimine, nakkushaiguste diagnostika).

PCR meetod põhineb loomulikul protsessil – DNA matriitsi komplementaarsel lõpetamisel, mis viiakse läbi DNA polümeraasi ensüümi abil. Seda reaktsiooni nimetatakse DNA replikatsioon.

Looduslik DNA replikatsioon koosneb mitmest etapist:

1) DNA denaturatsioon(kaksikheeliksi lahtikerimine, DNA ahelate lahknemine);

2) Lühikeste kaheahelaliste DNA segmentide moodustumine(DNA sünteesi algatamiseks vajalikud seemned);

3) Uue DNA ahela süntees(mõlema ahela täiendamine)

Seda protsessi saab kasutada koopiate saamiseks spetsiifilistele mikroorganismidele spetsiifilised lühikesed DNA segmendid, need. teostada selliste spetsiifiliste piirkondade sihtotsingut, mis on geenidiagnostika eesmärk tuvastada nakkushaiguste patogeene.

Termofiilsete bakterite termostabiilse DNA polümeraasi (Taq polümeraasi) avastamine Thermis aquaticus, mille optimaalne temperatuur jääb vahemikku 70-72°C, võimaldas muuta DNA replikatsiooni protsessi tsükliliseks ja kasutada seda tööks in vitro. Programmeeritavate termostaatide (võimendite) loomine, mis vastavalt etteantud programmile viivad läbi tsüklilist temperatuurimuutust, lõi eeldused PCR-meetodi laialdaseks kasutuselevõtuks laboratoorse kliinilise diagnostika praktikas. Sünteesitsüklite korduval kordamisel suureneb konkreetse DNA fragmendi koopiate arv eksponentsiaalselt, mis võimaldab saada väikesest kogusest analüüsitavast materjalist piisava arvu DNA koopiaid, mis võivad sisaldada üksikuid mikroorganismide rakke. , nende tuvastamiseks elektroforeesi abil.

Ahela täiendav lõpetamine ei alga ühestki DNA järjestuse punktist, vaid ainult teatud lähteplokkidest – lühikestest kaheahelalistest lõikudest. Kinnitades selliseid plokke DNA spetsiifiliste piirkondade külge, on võimalik suunata uue ahela sünteesi protsessi ainult selles piirkonnas, mitte aga kogu DNA ahela pikkuses. Antud DNA piirkondades lähteplokkide loomiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidpraimerit (20 nukleotiidipaari), nn. praimerid. Praimerid on komplementaarsed DNA järjestustega konkreetse fragmendi vasakpoolsel ja paremal piiril ning on orienteeritud nii, et uue DNA ahela valmimine toimub ainult nende vahel.

Seega on PCR spetsiifilise DNA piirkonna koopiate arvu (amplifikatsiooni) mitmekordne suurendamine, mida katalüüsib DNA polümeraasi ensüüm.

Võimendamiseks on vaja järgmisi komponente:

Deoksünukleotiidtrifosfaatide (dNTP) segu(segu neljast dNTP-st, mis on materjal uute komplementaarsete DNA ahelate sünteesiks)

Ensüüm Taq polümeraas(termostabiilne DNA polümeraas, mis katalüüsib praimerite ahelate pikenemist, lisades järjestikku nukleotiidaluseid sünteesitud DNA kasvavale ahelale).

puhverlahus(ensüümi aktiivsuse säilitamiseks vajalik Mg2+ ioone sisaldav reaktsioonikeskkond)
RNA-d sisaldavate viiruste genoomi spetsiifiliste piirkondade määramiseks saadakse esmalt RNA matriitsist DNA koopia, kasutades pöördtranskriptsiooni (RT) reaktsiooni, mida katalüüsib ensüüm pöördtranskriptaas (pöördtranskriptaas).

Soovitud iseloomuliku DNA fragmendi piisava arvu koopiate saamiseks hõlmab amplifikatsioon mitut (20-40) tsüklit.

Iga võimendustsükkel sisaldab 3 etappi, mis kulgevad erinevates temperatuuritingimustes 1. etapp: DNA denatureerimine(topeltspiraali lahtikerimine). See voolab 93-95°C juures 30-40 sekundit. 2. etapp: praimerite kinnitamine (anniilimine). Praimeri kinnitumine toimub komplementaarselt vastavate järjestustega vastassuunalistel DNA ahelatel konkreetse saidi piiridel. Igal praimerite paaril on oma lõõmutamistemperatuur, mille väärtused jäävad vahemikku 50-65°C. Lõõmutamise aeg -20-60 sek. 3. etapp: DNA ahelate ehitamine. DNA ahelate komplementaarne valmimine toimub ahela 5'-otsast 3'-otsa vastassuundades, alustades praimeri kinnituskohtadest. Uute DNA ahelate sünteesi materjaliks on lahusele lisatud desoksüribonukleotiidtrifosfaadid (dNTP-d). Sünteesiprotsessi katalüüsib ensüüm termostabiilne DNA polümeraas (Taq polümeraas) ja see toimub temperatuuril 70-72°C. Sünteesiaeg - 20-40 sek.

Esimeses amplifikatsioonitsüklis moodustunud uued DNA ahelad toimivad mallidena teise amplifikatsioonitsükli jaoks, milles moodustub soovitud spetsiifiline DNA fragment (amplikon). (vt joonis 2). Järgnevates amplifikatsioonitsüklites toimivad amplikonid uute ahelate sünteesi mallina. Seega toimub amplikonide kuhjumine lahuses valemi 2n järgi, kus n on võimendustsüklite arv. Seetõttu, isegi kui alglahuses oli algselt ainult üks kaheahelaline DNA molekul, koguneb lahusesse 30–40 tsükli järel umbes 108 amplikonimolekuli. Sellest kogusest piisab selle fragmendi usaldusväärseks visuaalseks tuvastamiseks agaroosgeelelektroforeesi abil. Võimendusprotsess viiakse läbi spetsiaalses programmeeritavas termostaadis (võimendis), mis vastavalt etteantud programmile muudab automaatselt temperatuure vastavalt võimendustsüklite arvule.

PCR ETAPID – ANALÜÜS

PCR-meetod kui nakkushaiguste laboratoorse diagnoosimise vahend põhineb ainult sellele mikroorganismile spetsiifilise patogeeni väikese DNA fragmendi (mitusada aluspaari) tuvastamisel, kasutades soovitud fragmendi akumuleerimiseks polümeraasi ahelreaktsiooni. .
PCR-meetodit kasutav analüüsimeetod koosneb kolmest etapist:

1. DNA (RNA) eraldamine kliinilisest proovist

2. Spetsiifiliste DNA fragmentide amplifitseerimine
3. Võimendusproduktide tuvastamine

DNA (RNA) eraldamine
Selles analüüsi etapis töödeldakse kliinilist proovi spetsiaalselt, mille tulemusena lüüsitakse rakumaterjal, eemaldatakse valkude ja polüsahhariidide fraktsioonid ning valmistatakse DNA- või RNA-vaba lahus.
inhibiitorid ja valmis edasiseks amplifikatsiooniks.
DNA (RNA) ekstraheerimise tehnika valiku määrab peamiselt töödeldava kliinilise materjali iseloom.

Spetsiifiliste DNA fragmentide amplifitseerimine
Selles etapis kogutakse lühikesi spetsiifilisi DNA fragmente nende edasiseks tuvastamiseks vajalikus koguses. Enamik genoomi spetsiifiliste fragmentide määramise meetodeid kasutab nn. "suunatud PCR klassikaline versioon. Analüüsi spetsiifilisuse ja tundlikkuse suurendamiseks kasutavad mõned meetodid "pesastatud" PCR-meetodit, mis kasutab 2 paari praimereid ("väline" - 1. etapi jaoks ja "sisemine" - 2. etapi jaoks).

Võimendusproduktide tuvastamine
Enamiku tehnikate puhul eraldatakse selles etapis 2. etapis saadud amplifikatsiooniproduktide segu horisontaalse agaroosgeelelektroforeesiga. Enne elektroforeetilist eraldamist lisatakse amplifikatsioonisegule etiidiumbromiidi lahust, mis moodustab tugevad interstitsiaalsed ühendused kaheahelaliste DNA fragmentidega. Need ühendid on UV-kiirguse toimel võimelised fluorestseeruma, mis registreeritakse pärast amplifikatsioonisegu elektroforeetilist eraldamist agaroosgeelis oranžikaspunaste helendavate ribadena.

Alternatiivina elektroforeetilisele tuvastamismeetodile, millel on mõned puudused: subjektiivsus tulemuste lugemisel, võib pakkuda piiranguid erinevate mikroorganismide DNA määramisel ühes reaktsioonis. hübridisatsiooni tuvastamise skeemid. Nendes skeemides hübridiseerub amplifikatsiooni tulemusena saadud DNA fragment (moodustab 2-ahelalisi komplekse - "hübriide") spetsiifilise oligonukleotiidsondiga. Selliste komplekside registreerimine võib toimuda kolorimeetriliselt või fluorimeetriliselt. SPC "Litekh" lõi tuvastamiskomplektid, mis põhinevad hübridisatsioonil ja tulemuste fluorimeetrilisel registreerimisel

PCR-MEETODI EELISED kui nakkushaiguste diagnoosimise meetod:

- Patogeenide esinemise otsene tuvastamine

Paljud traditsioonilised diagnostikameetodid, nagu ensüümseotud immunosorbentanalüüs, tuvastavad markervalgud, mis on nakkusetekitajate jääkproduktid, mis annavad ainult kaudseid tõendeid infektsiooni esinemise kohta. Patogeeni spetsiifilise DNA piirkonna tuvastamine PCR abil annab otsese viite nakkustekitaja olemasolule.

- Kõrge spetsiifilisus
PCR-meetodi kõrge spetsiifilisus tuleneb asjaolust, et uuritavas materjalis tuvastatakse ainulaadne ainult sellele patogeenile iseloomulik DNA fragment. Spetsiifilisus määratakse praimerite nukleotiidjärjestuse järgi, mis välistab
valede tulemuste saamise võimalus, erinevalt ensüümi immuunanalüüsi meetodist, kus ristreageerivate antigeenide tõttu on vead ebatavalised.

- Kõrge tundlikkus
PCR-meetod võimaldab tuvastada isegi üksikuid bakteri- või viirusrakke. PCR-diagnostika tuvastab nakkushaiguste patogeenide olemasolu juhtudel, kui kasutatakse muid meetodeid (immunoloogiline, bakterioloogiline,
mikroskoopiline) on võimatu. PCR analüüsi tundlikkus on 10-1000 rakku proovi kohta (immunoloogiliste ja mikroskoopiliste testide tundlikkus on 103-105 rakku).

-Erinevate patogeenide tuvastamise protseduuri universaalsus
PCR-uuringu materjaliks on patogeeni DNA. Meetod põhineb konkreetsele organismile spetsiifilise DNA või RNA fragmendi tuvastamisel. Kõigi nukleiinhapete keemilise koostise sarnasus võimaldab kasutada laboriuuringuteks ühtseid meetodeid. See võimaldab ühe biotesti põhjal diagnoosida mitu patogeeni. Uuritava materjalina võib kasutada erinevaid bioloogilisi eritisi (lima, uriin, röga), epiteelirakkude kraapimist, verd, seerumit.

- Analüüsi tulemuse saamise kiire kiirus
PCR-analüüs ei nõua patogeeni kultuuri eraldamist ja kultiveerimist, mis võtab palju aega. Ühtne meetod biomaterjali töötlemiseks ja reaktsioonisaaduste tuvastamiseks ning amplifikatsiooniprotsessi automatiseerimine võimaldab teostada terviklikku analüüsi 4-4,5 tunniga.

Tuleb märkida, et PCR meetod võimaldab tuvastada patogeene mitte ainult patsiendilt saadud kliinilises materjalis, vaid ka keskkonnaobjektidest (vesi, pinnas jne) saadud materjalis.

PCR-MEETODI RAKENDAMINE PRAKTILISES TERVISHOIUS

PCR-meetodi kasutamine nii bakteriaalse kui ka viirusliku iseloomuga nakkushaiguste diagnoosimisel on väga oluline paljude mikrobioloogia ja epidemioloogia probleemide lahendamisel. Selle meetodi kasutamine aitab kaasa ka fundamentaaluuringute arendamisele krooniliste ja väheuuritud nakkushaiguste valdkonnas.

Meetodi kõige tõhusam ja majanduslikult õigustatud kasutamine:

urogünekoloogiline praktika- klamüüdia, ureaplasmoosi, gonorröa, herpese, gardnerelloosi, mükoplasma infektsiooni tuvastamiseks;

pulmonoloogias- viirusliku ja bakteriaalse kopsupõletiku, tuberkuloosi diferentsiaaldiagnostikaks;

gastroenteroloogias- helikobakterioosi tuvastamiseks;

nakkushaiguste kliinikus- kiirmeetodina salmonelloosi, difteeria, viirusliku B-, C- ja G-hepatiidi diagnoosimisel;

hematoloogias- tsütomegaloviiruse infektsiooni, onkoviiruste tuvastamiseks.

1. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

2. Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhimõte

2.1 Reaktsioonisegus mitme komponendi olemasolu

2.2 Temperatuuritsüklid

2.3 Praimeri valiku põhiprintsiibid

2.4 Platooefekt

3. PCR seadistamise etapid

3.2 Võimendamine

3.4.1 Positiivsed juhtnupud

3.4.2 Sisekontroll

4.1 Kvalitatiivne analüüs

4.1.2 RNA molekulide tuvastamine

3.1 Bioloogilise materjali proovide ettevalmistamine

Sõltuvalt ülesannetest kasutatakse DNA ekstraheerimiseks erinevaid tehnikaid. Nende olemus seisneb DNA ekstraheerimises (ekstraheerimises) bioloogilisest tootest ja võõrlisandite eemaldamises või neutraliseerimises, et saada PCR jaoks sobiva puhtusega DNA preparaat.

Marmuri kirjeldatud puhta DNA preparaadi saamise meetodit peetakse standardseks ja see on juba muutunud klassikaliseks. See hõlmab ensümaatilist proteolüüsi, millele järgneb deproteiniseerimine ja DNA ümbersadestamine alkoholiga. See meetod võimaldab saada puhast DNA preparaati. Kuid see on üsna töömahukas ja hõlmab töötamist selliste agressiivsete ja teravate ainetega nagu fenool ja kloroform.

Üks praegu populaarseid meetodeid on DNA ekstraheerimise meetod, mille on välja pakkunud Boom et al. See meetod põhineb tugeva kaotroopse aine, guanidiintiotsüanaadi (GuSCN) kasutamisel rakkude lüüsiks ja sellele järgneval DNA sorptsioonil kandjal (klaashelmed, kobediatomiit, klaaspiim jne). Pärast pesemist jääb DNA kandjale adsorbeerunud proovi, kust seda saab elueerimispuhvriga hõlpsasti eemaldada. Meetod on mugav, tehnoloogiliselt arenenud ja sobib proovide ettevalmistamiseks võimendamiseks. Kuid DNA kadu on võimalik kandjal pöördumatu sorptsiooni tõttu, aga ka arvukate pesemiste käigus. See on eriti oluline proovis väikese koguse DNA-ga töötamisel. Lisaks võivad isegi väikesed GuSCN-i kogused pärssida PCR-i. Seetõttu on selle meetodi kasutamisel väga oluline sorbendi õige valik ja tehnoloogiliste nüansside hoolikas järgimine.

Teine proovide ettevalmistamise meetodite rühm põhineb Chilexi tüüpi ioonivahetite kasutamisel, mis erinevalt klaasist ei sorbeeri DNA-d, vaid vastupidi, reaktsiooni segavaid lisandeid. Reeglina sisaldab see tehnoloogia kahte etappi: proovi keetmine ja lisandite adsorptsioon ioonivahetile. Meetod on selle teostamise lihtsuse tõttu äärmiselt atraktiivne. Enamasti sobib see kliinilise materjaliga töötamiseks. Kahjuks on mõnikord proovides lisanditega, mida ei saa ioonivahetitega eemaldada. Lisaks ei saa mõningaid mikroorganisme hävitada lihtsa keetmisega. Nendel juhtudel on vaja sisse viia proovi töötlemise täiendavad etapid.

Seega tuleks proovi ettevalmistamise meetodi valikut käsitleda kavandatud analüüside eesmärkide mõistmisega.

3.2 Võimendamine

Amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimiseks on vaja reaktsioonisegu ette valmistada ja sellele lisada analüüsitud DNA proov. Sel juhul on oluline arvestada praimeri lõõmutamise mõningate omadustega. Fakt on see, et analüüsitavas bioloogilises proovis on reeglina erinevaid DNA molekule, millega reaktsioonis kasutatud praimerid on osalise, mõnel juhul olulise homoloogiaga. Lisaks võivad praimerid üksteisega liituda, moodustades praimer-dimeerid. Mõlemad põhjustavad kõrvalreaktsioonide (mittespetsiifiliste) produktide sünteesiks olulist praimerite tarbimist ja vähendavad selle tulemusena oluliselt süsteemi tundlikkust. See muudab reaktsiooni tulemuste lugemise elektroforeesi ajal keeruliseks või võimatuks.

3.3 Reaktsioonitulemuste hindamine

PCR-i tulemuste õigeks hindamiseks on oluline mõista, et see meetod ei ole kvantitatiivne. Teoreetiliselt saab üksikute sihtmärk-DNA molekulide amplifikatsiooniprodukte elektroforeesiga tuvastada juba 30–35 tsükli järel. Praktikas tehakse seda aga vaid juhtudel, kui reaktsioon toimub ideaalilähedastes tingimustes, mida elus sageli ei kohta. DNA preparaadi puhtusaste mõjutab eriti palju amplifikatsiooni efektiivsust; teatud inhibiitorite olemasolu reaktsioonisegus, millest mõnel juhul võib olla äärmiselt raske vabaneda. Mõnikord ei ole nende olemasolu tõttu võimalik amplifitseerida isegi kümneid tuhandeid sihtmärk-DNA molekule. Seega puudub sageli otsene seos sihtmärk-DNA esialgse koguse ja amplifikatsiooniproduktide lõpliku koguse vahel.

3.3.1 Horisontaalse elektroforeesi meetod

Võimendamistulemuste visualiseerimiseks kasutatakse erinevaid meetodeid. Tänapäeval on kõige levinum elektroforeesi meetod, mis põhineb DNA molekulide eraldamisel suuruse järgi. Selleks valmistatakse agaroosgeeli plaat, mis agaroos külmutatakse pärast sulatamist elektroforeesipuhvris kontsentratsiooniga 1,5-2,5%, lisades selleks spetsiaalset DNA-värvi, näiteks etiidiumbromiidi. Külmutatud agaroos moodustab ruumilise võre. Kammide abil valamisel moodustuvad geelis spetsiaalsed süvendid, millesse seejärel lisatakse võimendusproduktid. Geeliplaat asetatakse horisontaalsesse geelelektroforeesiaparaati ja ühendatakse püsipingeallikas. Negatiivselt laetud DNA hakkab geelis liikuma miinusest plussile. Samal ajal liiguvad lühemad DNA molekulid kiiremini kui pikad. DNA liikumise kiirust geelis mõjutavad agaroosi kontsentratsioon, elektrivälja tugevus, temperatuur, elektroforeesipuhvri koostis ja vähemal määral DNA GC koostis. Kõik ühesuurused molekulid liiguvad sama kiirusega. Värvaine on põimitud (interkaleerub) tasapinnalistes rühmades DNA molekulidesse. Pärast elektroforeesi lõppu, mis kestab 10 minutit kuni 1 tund, asetatakse geel ultraviolettkiirguse (254–310 nm) valgust kiirgava transilluminaatori filtrile. DNA neeldunud UV-energia lainepikkusel 260 nm kandub üle värvainele, põhjustades selle fluorestseerumise nähtava spektri oranžikas-punases piirkonnas (590 nm).

Võimendustoodete ribade heledus võib olla erinev. Seda ei saa aga seostada sihtmärk-DNA esialgse kogusega proovis.

3.3.2 Vertikaalse elektroforeesi meetod

Vertikaalse elektroforeesi meetod on põhimõtteliselt sarnane horisontaalse elektroforeesiga. Nende erinevus seisneb selles, et sel juhul kasutatakse agaroosi asemel polüakrüülamiidgeele. See viiakse läbi spetsiaalses vertikaalse elektroforeesi kambris. Polüakrüülamiidgeelelektroforeesil on suurem lahutusvõime kui agarooselektroforeesil ja see võimaldab eristada erineva suurusega DNA molekule ühe nukleotiidi täpsusega. Polüakrüülamiidgeeli valmistamine on mõnevõrra keerulisem kui agaroosi valmistamine. Lisaks on akrüülamiid mürgine aine. Kuna vajadus määrata amplifikatsiooniprodukti suurust 1 nukleotiidi täpsusega tekib harva, kasutatakse rutiinses töös horisontaalset elektroforeesi meetodit.

3.4 Amplifikatsioonireaktsiooni edenemise jälgimine

3.4.1 Positiivsed juhtnupud

"Positiivse kontrollina" kasutage soovitud mikroorganismi DNA preparaati. Mittespetsiifilised amplikonid erinevad suuruse poolest kontroll-DNA preparaadiga amplifikatsioonil genereeritud amplikonitest. Mittespetsiifiliste toodete suurus võib olla kas suurem või väiksem kui positiivne kontroll. Halvimal juhul võivad need mõõtmed kokku langeda ja loetakse elektroforeesis positiivseteks.

Saadud amplifikatsiooniprodukti spetsiifilisuse kontrollimiseks võib kasutada hübridisatsioonisonde (DNA piirkonnad, mis asuvad amplifitseeritavas järjestuses), mis on märgistatud ensüümimärgiste või radioaktiivsete isotoopidega ja interakteeruvad DNA-ga samadel põhimõtetel nagu praimerid. See raskendab ja pikendab analüüsi oluliselt ning selle maksumus suureneb oluliselt.

3.4.2 Sisekontroll

Igas reaktsioonisegu katseklaasis on vaja kontrollida amplifikatsiooni edenemist. Sel eesmärgil kasutatakse täiendavat, nn sisekontrolli. See on mis tahes DNA preparaat, mis ei sarnane soovitud mikroorganismi DNA-ga. Kui reaktsioonisegusse sisestatakse sisemine kontroll, muutub see praimeri anniilimise jaoks samaks sihtmärgiks kui soovitud nakkustekitaja kromosomaalne DNA. Sisekontrolli amplifikatsiooniprodukti suurus valitakse nii, et see oleks 2 või enam korda suurem kui mikroorganismi sihtmärk-DNA amplifitseerimisel tekkinud amplikonid. Selle tulemusena, kui sisekontroll-DNA viiakse reaktsioonisegusse koos uuritava prooviga, siis olenemata mikroorganismi olemasolust bioloogilises proovis, põhjustab sisekontroll spetsiifiliste amplikonide moodustumist, kuid palju kauem (raskemad) kui mikroorganismi amplikon. Raskete amplikonide olemasolu reaktsioonisegus näitab amplifikatsioonireaktsiooni normaalset kulgu ja inhibiitorite puudumist. Kui vajaliku suurusega amplikonid ei moodustunud, kuid ei moodustunud ka sisekontrolli amplikonid, võib järeldada, et analüüsitud proov sisaldab ebasoovitavaid lisandeid, mis tuleks kõrvaldada, kuid mitte soovitud DNA puudumist.

Kahjuks on selle lähenemisviisi kogu atraktiivsusest hoolimata sellel märkimisväärne viga. Kui reaktsioonisegus on vajalik DNA, siis selle amplifikatsiooni efektiivsus väheneb järsult konkurentsi tõttu praimerite sisekontrolliga. See on eriti oluline madala DNA kontsentratsiooni korral uuritavas proovis, mis võib viia valenegatiivsete tulemusteni.

Sellegipoolest, eeldusel, et praimerite konkurentsiprobleem on lahendatud, on see amplifikatsiooni efektiivsuse kontrollimise meetod kindlasti väga kasulik.

4. Polümeraasi ahelreaktsioonil põhinevad meetodid

4.1 Kvalitatiivne analüüs

Klassikaline PCR seadistamise meetod, mille põhimõtteid kirjeldati eespool, on välja töötatud mõnede modifikatsioonidena, mille eesmärk on ületada PCR piirangud ja suurendada reaktsiooni efektiivsust.

4.1.1 Kuidas seadistada PCR "kuumkäivituse" abil

Et vähendada amplifikatsioonireaktsiooni mittespetsiifiliste produktide tekkimise ohtu, kasutatakse "kuumkäivituse" meetodit, mille põhiolemus on vältida reaktsiooni käivitamise võimalust seni, kuni torus on saavutatud tingimused, mis tagavad toru spetsiifilise lõõmutamise. praimerid.

Fakt on see, et sõltuvalt HC koostisest ja suurusest on praimeritel teatud sulamistemperatuur (Tm). Kui süsteemi temperatuur ületab Tm, ei suuda praimer DNA ahelaga kinnituda ja denatureerub. Optimaalsetes tingimustes, s.o. sulamistemperatuurile lähedane anniilimistemperatuur, moodustab praimer kaheahelalise molekuli ainult siis, kui see on täielikult komplementaarne ja tagab seega reaktsiooni spetsiifilisuse.

"Kuumkäivituse" rakendamiseks on erinevaid võimalusi:

Taq polümeraasi lisamine reaktsioonisegusse esimese tsükli jooksul pärast toru kuumutamist denatureerimistemperatuurini.

Reaktsioonisegu koostisosade eraldamine parafiinikihiga kihtideks (alumises osas praimerid, ülemises osas Taq polümeraas ja sihtmärk DNA), mis segatakse parafiini sulamisel (~65-75 0 С).

Taq polümeraasi vastaste monoklonaalsete antikehade kasutamine. Monoklonaalsete antikehadega seotud ensüüm muutub aktiivseks alles pärast esimest denaturatsioonietappi, mil monoklonaalsed antikehad denatureerivad pöördumatult ja vabastavad Taq polümeraasi aktiivsed saidid.

Kõigil neil juhtudel, isegi kui mittespetsiifiline anniilimine toimus enne termilise tsükli algust, pikenemist ei toimu ja praimer-DNA kompleksid denatureeritakse kuumutamisel, nii et mittespetsiifilisi tooteid ei moodustu. Seejärel ei lange temperatuur torus alla sulamistemperatuuri, mis tagab spetsiifilise võimendusprodukti moodustumise.

4.1.2 RNA molekulide tuvastamine

Võimalus kasutada RNA-d PCR-i sihtmärgina laiendab oluliselt selle meetodi rakendusala. Näiteks paljude viiruste (C-hepatiit, gripiviirus, pikornaviirused jne) genoome esindab RNA. Samal ajal puudub nende elutsüklis DNA-ks muundumise vahefaas. RNA tuvastamiseks tuleb see esmalt muuta DNA-ks. Selleks kasutatakse pöördtranskriptaasi, mis eraldatakse kahest erinevast viirusest: lindude müeloblastoosi viirus ja Moloney hiire leukeemia viirus. Nende ensüümide kasutamine on seotud teatud raskustega. Esiteks on need termolabiilsed ja seetõttu saab neid kasutada temperatuuril mitte üle 42 ° C. Kuna sellel temperatuuril moodustavad RNA molekulid kergesti sekundaarseid struktuure, väheneb reaktsiooni efektiivsus märgatavalt ja on erinevatel hinnangutel ligikaudu 5%. Sellest puudusest püütakse mööda hiilida, kasutades pöördtranskriptaasina termostabiilset polümeraasi, mis on saadud termofiilsest mikroorganismist Thermus Thermophilus, millel on Mn2+ juuresolekul transkriptaasi aktiivsus. See on ainus teadaolev ensüüm, mis on võimeline avaldama nii polümeraasi kui ka transkriptaasi aktiivsust.

Pöördtranskriptsioonireaktsiooni läbiviimiseks peab reaktsioonisegu, nagu ka PCR-is, sisaldama seemnena praimereid ja ehitusmaterjalina 4 dNTP segu.

Pärast pöördtranskriptsiooni reaktsiooni võivad saadud cDNA molekulid olla PCR sihtmärgiks.

5. PCR seadistamise tehnoloogilise protsessi korraldus

Polümeraasi ahelreaktsiooni potentsiaalselt kõrge tundlikkus muudab PCR-i labori eriti hoolika ülesehituse hädavajalikuks. Selle põhjuseks on meetodi kõige teravam probleem - saastumine.

Saastumine - spetsiifiliste DNA molekulide sattumine väliskeskkonnast reaktsioonisegusse, mis võivad olla amplifikatsioonireaktsiooni sihtmärgid ja anda valepositiivseid tulemusi.

Selle ebameeldiva nähtusega toimetulemiseks on mitu võimalust. Üks neist on ensüümi N-uratsiilglükosülaasi (UG) kasutamine. See meetod põhineb UG võimel lõhustada DNA molekule manustatud uratsiiliga. Amplifitseerimisreaktsioon viiakse läbi dNTP seguga, milles dTTP on asendatud uratsiiliga, ja pärast termilist tsüklit sisaldavad kõik torus moodustunud amplikonid uratsiili. Kui reaktsioonisegule lisatakse HC enne amplifikatsiooni, hävivad reaktsioonisegusse sisenevad amplikonid, samas kui natiivne DNA jääb puutumatuks ja on seejärel amplifikatsiooni sihtmärk.

Seega kõrvaldab see meetod ainult teatud määral saasteallika ega garanteeri valepositiivsete tulemuste eest.

Teine viis saastumise tagajärgedega toimetulemiseks on reaktsioonitsüklite arvu märkimisväärne vähendamine (kuni 25-30 tsüklit). Kuid isegi selle lähenemisviisi korral on valepositiivsete tulemuste saamise oht suur, kuna sel juhul on inhibiitorite puudumisel saastumise tõttu lihtne saada amplifikatsiooniprodukti.

Seega, vaatamata valepositiivseid tulemusi põhjustavate DNA molekulide inaktiveerimisele suunatud amplifikatsioonieelsete meetmete eelistele, on kõige radikaalsem abinõu labori läbimõeldud korraldus.

Järeldus

PCR meetod on praegu enim kasutatav erinevate nakkushaiguste diagnoosimise meetodina. PCR võimaldab tuvastada nakkuse etioloogiat, isegi kui analüüsiks võetud proov sisaldab vaid mõnda patogeeni DNA molekuli. PCR-i kasutatakse laialdaselt HIV-nakkuste, viirushepatiidi jne varajasel diagnoosimisel. Praeguseks ei ole peaaegu ühtegi nakkustekitajat, mida ei saaks PCR abil tuvastada.