1966).

Rakukultuuri tehnikad arenesid märkimisväärselt 1940. ja 1950. aastatel seoses viroloogia valdkonna uurimistööga. Viiruste kasvatamine rakukultuurides võimaldas saada puhast viirusmaterjali vaktsiinide tootmiseks. Poliomüeliidi vaktsiin oli üks esimesi ravimeid, mida hakati rakukultuuritehnoloogia abil massiliselt tootma. 1954. aastal said Enders, Weller ja Robbins Nobeli preemia "poliomüeliidi viiruse võime avastamise eest erinevate kudede kultuurides kasvada". 1952. aastal töötati välja tuntud inimese vähi rakuliin HeLa.

Kasvatamise põhiprintsiibid[ | ]

Rakkude isoleerimine[ | ]

Väljaspool keha kasvatamiseks saab elusrakke saada mitmel viisil. Rakke saab verest eraldada, kuid kultuuris saavad kasvada ainult leukotsüüdid. Mononukleaarseid rakke saab eraldada pehmetest kudedest, kasutades ensüüme, nagu kollagenaas, trüpsiin ja pronaas, mis lagundavad rakuvälist maatriksit. Lisaks saab toitekeskkonda asetada kudede ja materjalide tükke.

Otse objektilt (ex vivo) võetud rakukultuure nimetatakse primaarseteks. Enamiku primaarsete rakkude eluiga, välja arvatud kasvajarakud, on piiratud. Pärast teatud arvu rakkude jagunemist vananevad sellised rakud ja lõpetavad jagunemise, kuigi võivad siiski jääda elujõuliseks.

On immortaliseeritud (“surematuid”) rakuliine, mis võivad lõpmatuseni paljuneda. Enamikus kasvajarakkudes on see võime juhusliku mutatsiooni tagajärg, kuid mõnes laboratoorses rakuliinis saadakse see kunstlikult, telomeraasi geeni aktiveerimise teel.

Rakukultuur[ | ]

Rakke kasvatatakse spetsiaalsetes toitainetes konstantsel temperatuuril. Taimerakukultuuride puhul kasutatakse kontrollitud valgustust, imetajarakkude puhul on tavaliselt vaja ka spetsiaalset gaasikeskkonda, mida hoitakse rakukultuuri inkubaatoris. Üldjuhul on reguleeritud süsihappegaasi ja veeauru kontsentratsioon õhus, kuid mõnikord ka hapniku kontsentratsioon. Erinevate rakukultuuride toitesöötmed erinevad koostise, glükoosi kontsentratsiooni, kasvufaktorite koostise jms poolest. Imetajate rakukultuurisöötmes kasutatavad kasvufaktorid lisatakse kõige sagedamini koos vereseerumiga. Üheks riskiteguriks on sel juhul rakukultuuri nakatumise võimalus prioonide või viirustega. Kasvatamisel on üheks oluliseks ülesandeks saastunud koostisosade kasutamise vältimine või minimeerimine. Praktikas seda aga alati ei saavutata. Parim, aga ka kõige kallim viis on seerumi asemel täiendada puhastatud kasvufaktoritega.

Rakuliinide ristsaastumine[ | ]

Rakukultuuridega töötades võivad teadlased silmitsi seista ristsaastumise probleemiga.

Kasvavate rakkude omadused[ | ]

Rakkude kasvatamisel võib pideva jagunemise tõttu tekkida nende üleküllus kultuuris ja sellest tulenevalt tekivad järgmised probleemid:

Rakukultuuride normaalse funktsioneerimise säilitamiseks, samuti negatiivsete nähtuste vältimiseks vahetatakse perioodiliselt toitekeskkonda, kiiritatakse ja transfekteeritakse rakke. Kultuuride bakterite, pärmi või muude rakuliinidega saastumise vältimiseks tehakse kõik manipulatsioonid tavaliselt aseptilistes tingimustes steriilses karbis. Söötmele võib mikrofloora pärssimiseks lisada antibiootikume (penitsilliin, streptomütsiin) ja seenevastaseid aineid (amfoteritsiin B).

Inimese rakkude kasvatamine on mõnevõrra vastuolus bioeetika reeglitega, kuna isolatsioonis kasvatatud rakud võivad ületada vanemorganismi ja neid kasutatakse siis katsete läbiviimiseks või uute ravimeetodite väljatöötamiseks ja sellest kasu saamiseks. Esimene kohtuotsus selles valdkonnas tehti California ülemkohtus kohtuasjas John Moore v. University of California, kus patsientidel ei ole omandiõigust rakuliinidele, mis on saadud nende nõusolekul eemaldatud elunditest.

hübridoom [ | ]

Rakukultuuride kasutamine[ | ]

Massrakukultuur on viirusvaktsiinide ja mitmesuguste biotehnoloogiatoodete tööstusliku tootmise aluseks.

Biotehnoloogia tooted[ | ]

Tööstusliku meetodiga rakukultuuridest toodetakse selliseid tooteid nagu ensüümid, sünteetilised hormoonid, monoklonaalsed antikehad, interleukiinid, lümfokiinid, kasvajavastased ravimid. Kuigi paljusid lihtsaid valke saab bakterikultuuride abil suhteliselt lihtsalt kätte, saab keerulisemaid valke, näiteks glükoproteiine, praegu saada ainult loomarakkudest. Üks neist olulistest valkudest on hormoon erütropoetiin. Imetajate rakukultuuride kasvatamise hind on üsna kõrge, mistõttu praegu uuritakse võimalust toota kompleksvalke putukate või kõrgemate taimede rakukultuurides.

koekultuurid[ | ]

Rakukultuur on koekultuuritehnoloogia ja koetehnoloogia lahutamatu osa, kuna see määrab aluse rakkude kasvatamiseks ja nende elujõulises seisundis hoidmiseks ex vivo.

Vaktsiinid [ | ]

Rakukultuuri tehnikaid kasutades toodetakse praegu poliomüeliidi, leetrite, mumpsi, punetiste, tuulerõugete vaktsiine. H5N1 gripipandeemia ohu tõttu rahastab Ameerika Ühendriikide valitsus praegu rakukultuure kasutava lindude gripi vaktsiini uurimist.

Mitteimetajate rakukultuurid[ | ]

Taimede rakukultuurid[ | ]

Taimerakukultuure kasvatatakse tavaliselt kas suspensioonina vedelas toitainekeskkonnas või kallusekultuurina tahkel toitainealusel. Diferentseerumata rakkude ja kalluse kasvatamine eeldab taimekasvuhormoonide auksiinide ja tsütokiniinide teatud tasakaalu säilitamist.

Bakteri-, pärmikultuurid[ | ]

Põhiartikkel:

Väikese arvu bakteri- ja pärmirakkude kultiveerimiseks plaaditakse rakud želatiinil või agar-agaril põhinevale tahkele toitekeskkonnale. Masstootmiseks kasutatakse kasvatamist vedelas toitainekeskkonnas (puljongis).

viiruskultuurid[ | ]

K.K. - Need on mitmerakulise organismi rakud, mis elavad ja paljunevad väljaspool keha tehistingimustes.

Väljaspool keha elavaid rakke või kudesid iseloomustab terve hulk metaboolseid, morfoloogilisi ja geneetilisi tunnuseid, mis erinevad järsult elundite ja kudede rakkude omadustest in vivo.

Ühekihilisi rakukultuure on kahte peamist tüüpi: esmane ja siirdatud.

Peamiselt trüpsiinitud. Mõiste "primaarne" viitab rakukultuurile, mis on saadud otse inimese või looma kudedest embrüonaalsel või postnataalsel perioodil. Selliste põllukultuuride eluiga on piiratud. Teatud aja pärast ilmnevad neis mittespetsiifilise degeneratsiooni nähtused, mis väljenduvad tsütoplasma granuleerimises ja vakuoliseerimises, rakkude ümardamises, side katkemises rakkude ja tahke substraadi vahel, millel neid kasvatati. Söötme perioodiline muutmine, viimase koostise muutmine ja muud protseduurid võivad vaid veidi pikendada primaarse rakukultuuri eluiga, kuid ei suuda ära hoida selle lõplikku hävimist ja surma. Suure tõenäosusega on see protsess seotud kogu organismis toimivate neurohumoraalsete tegurite kontrolli alt väljuvate rakkude metaboolse aktiivsuse loomuliku väljasuremisega.

Ainult populatsiooni üksikud rakud või rakurühmad võivad enamiku rakukihi degeneratsiooni taustal säilitada võime kasvada ja paljuneda. Need rakud, olles leidnud in vitro lõputu paljunemisvõime, tekitavad siirdatud rakukultuurid.

Siirdatavate rakuliinide peamine eelis võrreldes mis tahes primaarse kultuuriga on potentsiaal piiramatuks paljunemiseks väljaspool keha ja suhteline autonoomia, mis lähendab neid bakteritele ja üherakulistele algloomadele.

Suspensioonikultuurid- vedelsöötmes suspensioonina kasvatatud üksikud rakud või rakurühmad. Need on suhteliselt homogeenne rakupopulatsioon, mis puutuvad kergesti kokku kemikaalidega.

Suspensioonkultuure kasutatakse laialdaselt mudelsüsteemidena sekundaarsete metabolismi radade, ensüümide induktsiooni ja geeniekspressiooni, võõrühendite lagunemise, tsütoloogiliste uuringute jms uurimiseks.

"Hea" liini tunnuseks on rakkude võime ainevahetust ümber korraldada ja kõrge paljunemiskiirus konkreetsetes kultiveerimistingimustes. Sellise joone morfoloogilised omadused:

kõrge lagunemisaste (5-10 rakku rühma kohta);

rakkude morfoloogiline ühtlus (väike suurus, sfääriline või ovaalne kuju, tihe tsütoplasma);

Trahheiditaoliste elementide puudumine.

Diploidsed rakutüved. Need on sama tüüpi rakud, mis on võimelised in vitro läbima kuni 100 jagunemist, säilitades samal ajal algse diploidse kromosoomikomplekti rikke (Hayflick, 1965). Inimese embrüotest pärinevaid diploidseid fibroblastide tüvesid kasutatakse laialdaselt diagnostilises viroloogias ja vaktsiinide tootmises, samuti eksperimentaalsetes uuringutes. Tuleb meeles pidada, et mõned viiruse genoomi tunnused realiseeruvad ainult rakkudes, mis säilitavad normaalse diferentseerumistaseme.

130. Bakteriofaagid. Morfoloogia ja keemiline koostis

Bakteriofaagid (faagid) (teisest kreeka keelest φᾰγω - "ma õgin") on viirused, mis nakatavad valikuliselt bakterirakke. Kõige sagedamini paljunevad bakteriofaagid bakterite sees ja põhjustavad nende lüüsi. Bakteriofaag koosneb reeglina valgukestast ja üheahelalise või kaheahelalise nukleiinhappe (DNA või harvemini RNA) geneetilisest materjalist. Osakeste suurus on ligikaudu 20 kuni 200 nm.

Erinevate bakteriofaagide osakeste – virioonide – struktuur on erinev. Erinevalt eukarüootsetest viirustest on bakteriofaagidel sageli bakteriraku pinnale spetsiaalne kinnitusorgan ehk sabaprotsess, mis on paigutatud erineva keerukusega, kuid mõnel faagil puudub sabaprotsess. Kapsiid sisaldab faagi geneetilist materjali, selle genoomi. Erinevate faagide geneetilist materjali võivad esindada erinevad nukleiinhapped. Mõned faagid sisaldavad geneetilise materjalina DNA-d, teised aga RNA-d. Enamiku faagide genoom on kaheahelaline DNA ja mõnede suhteliselt haruldaste faagide genoom on üheahelaline DNA. Mõne faagi DNA molekulide otstes on "kleepuvad alad" (üheahelalised komplementaarsed nukleotiidjärjestused), teistes faagides kleepuvad alad puuduvad. Mõnel faagil on DNA molekulides ainulaadsed geenijärjestused, samas kui teistel faagidel on geenide permutatsioonid. Mõnes faagis on DNA lineaarne, teistes on see suletud rõngas. Mõnel faagil on DNA molekuli otstes mitme geeni terminaalsed kordused, samas kui teistes faagides tagab selle terminaalse liiasuse suhteliselt lühikeste korduste olemasolu. Lõpuks on mõnes faagis genoom esindatud mitme nukleiinhappefragmendi komplektiga.

Evolutsioonilisest vaatenurgast erinevad nii erinevat tüüpi geneetilist materjali kasutavad bakteriofaagid üksteisest palju suuremal määral kui ükski teine ​​eukarüootsete organismide esindaja. Samal ajal, hoolimata sellistest fundamentaalsetest erinevustest geneetilise teabe kandjate - nukleiinhapete - struktuuris ja omadustes, näitavad erinevad bakteriofaagid paljudes aspektides ühtsust, peamiselt nende sekkumise olemuses raku ainevahetusse pärast tundlike bakterite nakatumist.

Bakteriofaagid, mis on võimelised põhjustama produktiivset rakkude nakatumist, st. infektsioon, mille tulemuseks on elujõulised järglased, määratletakse kui mittedefektne. Kõikidel mittedefektsetel faagidel on kaks olekut: rakuvälise ehk vaba faagi olek (mida mõnikord nimetatakse ka küpseks faagiks) ja vegetatiivse faagi olek. Mõne nn parasvöötme faagi puhul on võimalik ka profaagi olek.

Ekstratsellulaarne faag on osakesed, millel on seda tüüpi faagidele iseloomulik struktuur, mis tagab faagi genoomi säilimise infektsioonide vahel ja selle viimist järgmisse tundlikku rakku. Ekstratsellulaarne faag on biokeemiliselt inertne, samas kui vegetatiivne faag, faagi aktiivne (“elus”) olek, tekib pärast tundlike bakterite nakatumist või pärast profaagi esilekutsumist.

Mõnikord ei põhjusta tundlike rakkude nakatumine mittedefektse faagiga elujõuliste järglaste moodustumist. See võib juhtuda kahel juhul: abortiivse infektsiooni ajal või raku lüsogeense seisundi tõttu parasvöötme faagiga nakatumise ajal.

Nakkuse katkemise põhjuseks võib olla teatud rakusüsteemide aktiivne sekkumine infektsiooni käigus, näiteks bakterisse viidud faagi genoomi hävimine või mõne rakus vajaliku toote puudumine. faagi areng jne.

Faagid liigitatakse tavaliselt kolme tüüpi. Tüübi määrab produktiivse faagiinfektsiooni mõju olemus nakatunud raku saatusele.

Esimene tüüp on tõeliselt virulentsed faagid. Raku nakatamine virulentse faagiga põhjustab paratamatult nakatunud raku surma, selle hävimise ja järglasfaagi vabanemise (v.a abortiivse infektsiooni juhud). Selliseid faage nimetatakse tõeliselt virulentseteks, et eristada neid virulentsetest parasvöötme faagimutantidest.

Teine tüüp- parasvöötme faagid. Raku produktiivse nakatumise käigus parasvöötme faagiga on võimalik kaks põhimõtteliselt erinevat arenguviisi: lüütiline, üldiselt (oma tulemuselt) sarnane virulentsete faagide lüütilise tsükliga ja lüsogeenne, kui mõõduka faagi genoom läheb eriseisundisse – profaagiks. Profaagi kandvat rakku nimetatakse lüsogeenseks või lihtsalt lüsogeeniks (kuna see võib teatud tingimustel läbida faagilüütilise arengu). Parasvöötme faage, mis reageerivad profaagi olekus indutseeriva teguri rakendamisele lüütilise arengu algusega, nimetatakse indutseeritavateks, ja faage, mis sel viisil ei reageeri, nimetatakse mitteindutseeritavateks. Virulentsed mutandid võivad esineda parasvöötme faagides. Virulentsusmutatsioonid viivad sellise muutuseni operaatorpiirkondade nukleotiidide järjestuses, mis kajastub afiinsuse kadumises repressori suhtes.

Kolmas faagitüüp on faagid, mille produktiivne nakatumine ei too kaasa bakterite surma. Need faagid on võimelised nakatunud bakterist lahkuma, põhjustamata selle füüsilist hävitamist. Sellise faagiga nakatunud rakk on pideva (püsiva) produktiivse infektsiooni seisundis. Faagi areng põhjustab bakterite jagunemise kiiruse mõningast aeglustumist.

Bakteriofaagid erinevad keemilise struktuuri, nukleiinhappe tüübi, morfoloogia ja koostoime poolest bakteritega. Bakteriaalsed viirused on sadu ja tuhandeid kordi väiksemad kui mikroobirakud.

Tüüpiline faagiosake (virion) koosneb peast ja sabast. Saba pikkus on tavaliselt 2-4 korda suurem pea läbimõõdust. Pea sisaldab geneetilist materjali - üheahelalist või kaheahelalist RNA-d või DNA-d, mille transkriptaasi ensüüm on inaktiivses olekus, ümbritsetud valgu- või lipoproteiini kestaga - kapsiidiga, mis säilitab genoomi väljaspool rakku.

Nukleiinhape ja kapsiid koos moodustavad nukleokapsiidi. Bakteriofaagidel võib olla ikosaeedriline kapsiid, mis on kokku pandud ühe või kahe spetsiifilise valgu mitmest koopiast. Tavaliselt koosnevad nurgad valgu pentameeridest ja kummagi külje tugi sama või sarnase valgu heksameeridest. Lisaks võivad faagid olla sfäärilised, sidrunikujulised või pleomorfsed. Saba on valgutoru - pea valgukesta jätk, saba põhjas on ATPaas, mis regenereerib energiat geneetilise materjali süstimiseks. Samuti on bakteriofaagid lühikese protsessiga, ilma protsessita ja filamentsed.

Faagide põhikomponendid on valgud ja nukleiinhapped. Oluline on märkida, et faagid, nagu ka teised viirused, sisaldavad ainult ühte tüüpi nukleiinhapet, desoksüribonukleiinhapet (DNA) või ribonukleiinhapet (RNA). Selle omaduse poolest erinevad viirused mikroorganismidest, mis sisaldavad oma rakkudes mõlemat tüüpi nukleiinhappeid.

Nukleiinhape asub peas. Väike kogus valku (umbes 3%) leiti ka faagipea seest.

Seega on faagid keemilise koostise järgi nukleoproteiinid. Sõltuvalt nende nukleiinhappe tüübist jagatakse faagid DNA-ks ja RNA-ks. Valgu ja nukleiinhappe hulk erinevates faagides on erinev. Mõnes faagis on nende sisaldus peaaegu sama ja igaüks neist komponentidest on umbes 50%. Teistes faagides võib nende põhikomponentide suhe olla erinev.

Lisaks nendele põhikomponentidele sisaldavad faagid väikeses koguses süsivesikuid ja mõningaid valdavalt neutraalseid rasvu.

Joonis 1: Faagiosakese struktuuri skeem.

Kõik teadaolevad teist morfoloogilist tüüpi faagid on RNA. Kolmanda morfoloogilise tüübi faagide hulgas leidub nii RNA kui ka DNA vorme. Teiste morfoloogiliste tüüpide faagid on DNA-tüüpi.

131. Interferoon. Mis see on?

Sekkuda O n(ladina keelest inter - vastastikku, omavahel ja ferio - löön, löön), kaitsevalk, mida toodavad imetajate ja lindude keharakud, aga ka rakukultuurid vastusena nende viirustega nakatumisele; pärsib viiruste paljunemist (replikatsiooni) rakus. I. avastasid 1957. aastal inglise teadlased A. Isaacs ja J. Lindenman nakatunud kanade rakkudest; hiljem selgus, et I. teket põhjustavad ka bakterid, riketsia, toksiinid, nukleiinhapped, sünteetilised polünukleotiidid. I. ei ole üksikaine, vaid rühm madala molekulmassiga valke (molekulmass 25 000–110 000), mis on stabiilsed laias pH-tsoonis, resistentsed nukleaaside suhtes ja lagunevad proteolüütiliste ensüümide toimel. Tekkimine I. rakkudes on seotud viiruse arenguga neis, see tähendab, et see on raku reaktsioon võõra nukleiinhappe tungimisele. Pärast nakatava viiruse kadumist rakust ja normaalsetes rakkudes Ja. seda ei leitud. Toimemehhanismi järgi erineb I. põhimõtteliselt antikehadest: ei ole spetsiifiline viirusnakkustele (toimib erinevate viiruste vastu), ei neutraliseeri viiruse nakkavust, vaid pärsib selle paljunemist organismis, pärssides sünteesi. viiruse nukleiinhapetest. Kui see siseneb rakkudesse pärast viirusinfektsiooni tekkimist neis, ei ole I. efektiivne. Pealegi on And. reeglina spetsiifiline seda moodustavatele rakkudele; näiteks kanarakkude I. on aktiivne ainult nendes rakkudes, kuid ei pärsi viiruse paljunemist küüliku või inimese rakkudes. Arvatakse, et viirustele ei mõju mitte I. ise, vaid mõni teine ​​tema mõjul toodetud valk. Viirushaiguste (herpeetiline silmainfektsioon, gripp, tsütomegaalia) profülaktika ja ravi I. testimisel on saadud julgustavaid tulemusi. I. laialdast kliinilist kasutamist piirab aga ravimi kättesaamise raskus, vajadus korduva organismi manustamise järele ja selle liigispetsiifilisus.

132. Disjunktiivne viis. Mis see on?

1.Produktiivne viirusinfektsioon esineb kolmel perioodil:

· algperiood hõlmab viiruse rakule adsorptsiooni, rakku tungimise, viiruse lagunemise (deproteiniseerimise) või "lahtiriietumise" etappe. Viiruse nukleiinhape viidi sobivatesse rakustruktuuridesse ja lüsosomaalsete rakuensüümide toimel vabaneb kaitsvatest valgukatetest. Selle tulemusena moodustub unikaalne bioloogiline struktuur: nakatunud rakk sisaldab 2 genoomi (oma ja viirus) ja 1 sünteetilist aparaati (rakuline);

Pärast seda algab teine ​​rühm viiruste paljunemisprotsessid, sealhulgas keskmine ja viimased perioodid, mille käigus toimub raku represseerimine ja viiruse genoomi ekspressioon. Rakulise genoomi represseerimise tagavad madala molekulmassiga reguleerivad valgud, nagu histoonid, mida sünteesitakse mis tahes rakus. Viirusnakkuse korral on see protsess tõhustatud, nüüd on rakk struktuur, milles geneetilist aparaati esindab viiruse genoom ja sünteetilist aparaati esindavad raku sünteetilised süsteemid.

2. Juhtub sündmuste edasine kulg rakusviiruse nukleiinhapete replikatsiooniks(uute virionide geneetilise materjali süntees) ja selles sisalduva geneetilise teabe rakendamine(valgukomponentide süntees uute virionide jaoks). DNA-d sisaldavates viirustes, nii prokarüootsetes kui ka eukarüootsetes rakkudes, toimub viiruse DNA replikatsioon raku DNA-st sõltuva DNA polümeraasi osalusel. Sel juhul tekivad esmalt üheahelalised DNA-d sisaldavad viirused täiendavad ahel - niinimetatud replikatiivne vorm, mis toimib tütar-DNA molekulide mallina.

3. DNA-s sisalduva viiruse geneetilise teabe rakendamine toimub järgmiselt: DNA-sõltuva RNA polümeraasi osalusel sünteesitakse mRNA-sid, mis sisenevad raku ribosoomidesse, kus sünteesitakse viirusspetsiifilisi valke. Kaheahelalistes DNA-d sisaldavates viirustes, mille genoom transkribeeritakse peremeesraku tsütoplasmas, on see tema enda genoomne valk. Viirused, mille genoomid transkribeeritakse raku tuumas, kasutavad seal sisalduvat raku DNA-sõltuvat RNA polümeraasi.

Kell RNA viirused protsessid replikatsioon nende genoom, transkriptsioon ja geneetilise informatsiooni translatsioon viiakse läbi muul viisil. Viiruse RNA replikatsioon, nii miinus- kui ka plussahelad, toimub RNA replikatiivse vormi kaudu (komplementaarne originaalile), mille sünteesi tagab RNA-sõltuv RNA polümeraas, genoomne valk, mis on kõigil RNA-d sisaldavatel viirustel. . Miinusahelaga viiruste RNA replikatiivne vorm (pluss-ahel) ei toimi mitte ainult tütarviiruse RNA molekulide (miinusahelate) sünteesi mallina, vaid täidab ka mRNA funktsioone, st läheb ribosoomidesse ja tagab viirusvalkude süntees (saade).

Kell pluss-filament RNA-d sisaldavad viirused täidavad selle koopiate translatsioonifunktsiooni, mille süntees viiakse läbi replikatiivse vormi (negatiivse ahela) kaudu viiruse RNA-st sõltuvate RNA polümeraaside osalusel.

Mõnedel RNA viirustel (reoviirused) on täiesti ainulaadne transkriptsioonimehhanism. Seda pakub spetsiifiline viiruse ensüüm - pöördtranskriptaas (pöördtranskriptaas) ja seda nimetatakse pöördtranskriptsiooniks. Selle olemus seisneb selles, et algul moodustub viiruse RNA maatriksil pöördtranskriptsiooni osalusel transkript, mis on DNA üks ahel. Sellel sünteesitakse raku DNA-st sõltuva DNA polümeraasi abil teine ​​ahel ja moodustub kaheahelaline DNA transkript. Sellest realiseerub tavapärasel viisil i-RNA moodustumise kaudu viiruse genoomi teave.

Kirjeldatud replikatsiooni, transkriptsiooni ja translatsiooni protsesside tulemus on moodustumine tütarmolekulid viiruse nukleiinhape ja viiruslikud valgud kodeeritud viiruse genoomis.

Pärast seda tuleb kolmas, viimane periood viiruse ja raku vaheline interaktsioon. Raku tsütoplasmaatilise retikulumi membraanidel olevatest struktuurikomponentidest (nukleiinhapped ja valgud) monteeritakse kokku uued virioonid. Rakk, mille genoom on represseeritud (supresseeritud), tavaliselt sureb. äsja moodustunud virionid passiivselt(rakusurma tõttu) või aktiivselt(pungades) lahkuvad rakust ja leiavad end selle keskkonnas.

Sellel viisil, viiruse nukleiinhapete ja valkude süntees ning uute virioonide kokkupanek esinevad teatud järjestuses (ajaliselt eraldatud) ja erinevates rakustruktuurides (ruumiliselt eraldatud), millega seoses sai ka viiruste paljunemismeetodi nime. disjunktiivne(lahutatud). Aborduva viirusinfektsiooni korral katkeb viiruse interaktsiooni protsess rakuga ühel või teisel põhjusel enne, kui raku genoomi allasurumine on toimunud. Ilmselgelt sel juhul viiruse geneetiline informatsioon ei realiseeru ja viiruse paljunemist ei toimu ning rakk säilitab oma funktsioonid muutumatuna.

Varjatud viirusnakkuse ajal toimivad rakus mõlemad genoomid üheaegselt, viiruse poolt indutseeritud transformatsioonide käigus aga muutub viiruse genoom raku osaks, toimib ja pärandub koos sellega.

133. Camelpox viirus

Rõuged (Variola)- nakkuslik nakkushaigus, mida iseloomustab palavik ning papulaarne-pustuloosne lööve nahal ja limaskestadel.
Haiguse tekitajad kuuluvad rõugete ( Poxviridae ) perekonna erinevatesse perekondadesse ja tüüpidesse. Sõltumatud liigid on viirused: looduslik lehma yuspa, vaktsiinia (perekond Orthopoxvirus), looduslikud lambarõuged, kitsed (perekond karpkalaviirused), sead (perekond Suipoxvirus), linnud (perekond Avipoxvirus) kolme põhiliigiga (kanade, tuvide ja rõugete tekitajad kanaarilind).
Rõugete patogeenid erinevad loomaliigid on morfoloogiliselt sarnased. Need on DNA-d sisaldavad viirused, mida iseloomustavad suhteliselt suured mõõtmed (170 - 350 nm), epiteelitroopia ja võime moodustada rakkudes elementaarseid ümardatud inklusioone (Paschen, Guarnieli, Bollingeri kehad), mis on pärast Moro-zovi järgi värvimist nähtavad valgusmikroskoobi all. Kuigi eksisteerib fülogeneetiline Rõugete tekitajate vahel eri loomaliikidel on tugev seos, ei ole patogeensuse spekter sama ja immunogeensed seosed ei säili kõigil juhtudel. Lammaste, kitsede, sigade ja lindude variolaviirused on patogeensed ainult vastavatele liikidele ning looduslikes tingimustes põhjustab igaüks neist iseseisva (algse) rõuge. Variola lehmarõugete ja vaktsiinia viirustel on lai patogeensuse spekter, sealhulgas veised, pühvlid, paatkonnad, eeslid, muulad, kaamelid, küülikud, ahvid ja inimesed.

Kaameli rõuged VARIOLA CAMELINA nakkav haigus, mis tekib iseloomuliku sõlme-pustuloosse rõugelööbe tekkega nahal ja limaskestadel. Rõugete nimetus Variola tuleb ladinakeelsest sõnast Varus, mis tähendab kõverat (pockmarked).

Haiguse epizootoloogia. Igas vanuses kaamelid on rõugetele vastuvõtlikud, kuid noorloomad haigestuvad sagedamini ja raskemini. Rõugeprobleemidega statsionaarsetes piirkondades haigestuvad täiskasvanud kaamelid harva, kuna peaaegu kõik nad haigestuvad rõugetesse noores eas. Tiinetel kaamelitel võivad rõuged põhjustada aborte.

Teiste liikide loomad ei ole looduslikes tingimustes vastuvõtlikud algsele kaambelõugeviirusele. Lehmarõugeviirusele ja vaktsiiniale on lisaks lehmadele ja kaamelitele vastuvõtlikud pühvlid, hobused, eeslid, sead, küülikud ja inimesed, kes pole rõugete suhtes immuunsed. Laboratoorsetest loomadest on merisead tundlikud lehmarõugete ja vaktsiiniaviiruste suhtes pärast seda, kui viirus on kantud silma sarvkestale (F. A. Petunii, 1958).

Peamised rõugeviiruste allikad on rõugeloomad ja vaktsiiniat põdevad inimesed, kes taastuvad ülitundlikkusest pärast vaktsiiniaviirusega immuniseerimist rõugevasika detriidi korral. Haiged loomad ja inimesed levitavad viirust väliskeskkonnas, peamiselt viirust sisaldava naha ja limaskestade äratõukunud epiteeliga. Väliskeskkonda satub viirus ka aborteerunud loodetega (K. N. Buchnev ja R. G. Sadykov, 1967). Rõugete tekitajat võivad mehaaniliselt levitada rõugetele immuunsed kodu- ja metsloomad, sealhulgas linnud, aga ka rõugete suhtes immuunsed inimesed vaktsiiniaga vaktsineeritud lastelt.

Looduslikes tingimustes nakatuvad terved kaamelid kokkupuutel haigete loomadega viirusega saastunud piirkonnas nakatunud vee, sööda, ruumide ja hooldusvahendite kaudu, samuti aerogeenselt, kui haiged loomad pritsivad viirust sisaldavaid väljavoolusid. Sagedamini nakatuvad kaamelid siis, kui viirus läbi naha ja limaskestade kehasse satub, eriti kui nende terviklikkus on rikutud või kui tekib A-vitamiini puudus.

Episootia kujul esineb rõuge kaamelitel ligikaudu iga 20-25 aasta järel. Sel ajal on noorloomad eriti raskelt haiged. Episootiate vahelisel perioodil kaamelite seas rõugetega paiksetes piirkondades esineb rõuge ensootiliste ja juhuslike haigusjuhtude kujul, mis esinevad enam-vähem regulaarselt iga 3-6 aasta tagant, peamiselt 2-4-aastastel loomadel. Sellistel juhtudel haigestuvad loomad suhteliselt kergesti, eriti soojal aastaajal. Külma ilmaga on rõuged raskemad, pikemad ja sellega kaasnevad tüsistused, eriti noorloomadel. Väikestes farmides haigestuvad peaaegu kõik vastuvõtlikud kaamelid 2-4 nädala jooksul. Arvestada tuleb, et kaamelite seas võivad rõugepuhangud olla põhjustatud nii algsest kaameli- kui ka lehmarõugeviirusest, mis üksteise vastu immuunsust ei loo. Seetõttu võivad erinevate rõugeviiruste põhjustatud puhangud üksteisele järgneda või ilmneda samaaegselt.

Patogenees määrab patogeeni väljendunud epiteliotropism. Looma kehasse sattudes viirus paljuneb ja tungib verre (vireemia), lümfisõlmedesse, siseorganitesse, naha ja limaskestade epiteelikihti ning põhjustab neis spetsiifiliste eksanteemide ja enanteemide moodustumist, raskusastet. millest sõltub organismi reaktsioonivõimest ja viiruse virulentsusest, kehasse tungimise teedest ja epiteelikihi seisundist. Pokid arenevad järjestikku etappidena: sõlmekesega roseoolist kuni kooriku ja armide moodustumisega pustulini.

Sümptomid. Inkubatsiooniperiood, olenevalt kaamelite vanusest, viiruse omadustest ja organismi sattumisest, on 3–15 päeva: noorloomadel 4–7, täiskasvanutel 6–15 päeva. Immuunsuseta kaamelid võivad haigestuda 2-5 päeva pärast sündi. Lühim peiteaeg (2-3 päeva) esineb kaamelitel pärast seda, kui nad on nakatunud vaktsiiniaviirusega.

Prodromaalsel perioodil tõuseb haigetel kaamelitel kehatemperatuur 40–41 ° C-ni, ilmneb letargia ja toitumisest keeldumine, sidekesta ning suu ja nina limaskestad on hüpereemilised. Neid märke on aga sageli näha, eriti haiguse alguse alguses farmis.

Kaamelite rõugete kulg on olenevalt vanusest samuti erinev: noorloomadel, eriti vastsündinul, on see sagedamini äge (kuni 9 päeva); täiskasvanutel - alaäge ja krooniline, mõnikord varjatud, sagedamini tiinetel kaamelitel. Kaamelite rõugete kõige iseloomulikum vorm on kutaanne ja haiguse alaägeda kulgemisega (joon. 1).

Haiguse alaägedas kulgemises eraldub suust ja ninast selge, hiljem hägune, hallikas-määrdunud lima. Loomad raputavad pead, nuusutavad ja nurruvad, paiskades välja viirusest mõjutatud epiteeli koos viirust sisaldava limaga. Peagi tekib huulte, ninasõõrmete ja silmalaugude piirkonnas tursed, mis mõnikord levivad lõualuude vahelisele piirkonnale, kaelale ja isegi õlavarrele. Submandibulaarsed ja alumised emakakaela lümfisõlmed on laienenud. Loomadel on söögiisu vähenenud, nad lamavad sagedamini ja kauem kui tavaliselt ning tõusevad üles suurte raskustega. Selleks ajaks ilmuvad huulte, nina ja silmalaugude nahale, suu ja nina limaskestale punakashallid laigud; nende alla moodustuvad tihedad sõlmekesed, mis suurenedes muutuvad halliks papulideks ja seejärel herne- ja oasuurusteks mädavillideks, mille keskpunkt on vajunud ja servi mööda rullitaoline paksenemine.

Pustulid pehmenevad, lõhkevad ja neist eraldub helehalli värvi kleepuv vedelik. Pea turse selleks ajaks kaob. 3-5 päeva pärast kaetakse avatud pustulid koorega. Kui koresööt neid ei vigasta, siis haigus sellega ka lõpeb. Eemaldatud või mahakukkunud primaarsetel koorikutel on vastupidine kraatritaoline pustulite vorm. Pockmarkide asemele jäävad armid. Kõik need kahjustused nahal tekivad 8-15 päeva jooksul.

Haigetel kaamelitel tekivad taskud sageli esmalt pähe. Ühe kuni nelja aasta vanuselt haigestuvad kaamelid reeglina kergesti. Kahjustused paiknevad peanahal, peamiselt huultel ja ninas. Kaamelitel on udar sageli kahjustatud. Paar päeva pärast esmaste pustulite avanemist peapiirkonnas tekivad rõugekolded nahale ja teistele madala karvaga kehapiirkondadele (rinna, kaenlaaluste, kõhukelme ja munandikoti piirkondades, päraku ümbruses, siseküljel küünarvarre ja reie) ning kaamelitel ka tupe limaskestal. Sel ajal tõuseb kaamelite kehatemperatuur tavaliselt uuesti, mõnikord kuni 41,5 ° -ni, ja kaamelid toovad viimasel raseduskuul enneaegseid ja vähearenenud kaameleid, kes reeglina varsti surevad.

Mõnel loomal muutub silma sarvkest (okkas) häguseks, mis põhjustab ühest silmast ajutist pimedaksjäämist 5-10 päevaks ja kaamelitel sagedamini mõlemas silmas. Kaameli vasikatel, kes haigestuvad vahetult pärast sündi, tekib kõhulahtisus. Sel juhul surevad nad 3-9 päeva jooksul pärast haigust.

Rõugete suhteliselt healoomulise alaägeda kulgemise korral ja tavaliselt pärast vaktsiiniaviirusega nakatumist paranevad loomad 17-22 päevaga.

Täiskasvanud kaamelitel suulimaskesta avanevad pustulid sageli ühinevad ja veritsevad, eriti kui neid on vigastatud koresööda tõttu. See raskendab söötmist, loomad kaotavad kaalu, paranemisprotsess viibib kuni 30-40 päeva ja haigus muutub krooniliseks.

Rõugeprotsessi üldistades tekib mõnikord püeemia ja tüsistused (kopsupõletik, gastroenteriit, nekrobakterioos jne.) Sellistel juhtudel kestab haigus kuni 45 päeva või kauem. Esineb mao ja soolte talitlushäireid, millega kaasneb atoonia ja kõhukinnisus. Mõnel haigel loomal täheldatakse jäsemete turset.

Varjatud rõugete kulgu (ilma iseloomulike kliiniliste haigustunnusteta, ainult palaviku korral) kaamelitel tekivad abordid 1-2 kuud enne varssamist (kuni 17-20%).

Täiskasvanud kaamelite haiguse prognoos on soodne, ägeda kulgemisega kaamelitel, eriti 15-20 päeva vanuselt ja mitteimmuunsusest rõugedeni sündinud kaamelitel, ebasoodne. Kaamelid on raskelt haiged ja kuni 30-90% neist sureb. 1-3-aastased kaamelid haigestuvad kergemini rõugetesse ja vanemas eas, kuigi nad on raskelt haiged, on väljendunud üldistatud protsessi tunnustega suremus madal (4-7%).

Patoloogilisi muutusi iseloomustavad ülalkirjeldatud naha, limaskestade ja silma sarvkesta kahjustused. Epikardil ja soole limaskestal on täheldatud täpseid hemorraagiaid. Rinnaõõnes rannikualal on mõnikord näha ka väikesed verejooksud ja sõlmekesed, mille suurus ulatub hirsiterast kuni halli ja hallikaspunase värvusega kalgenda sisuga läätsedeni. Söögitoru limaskest on kaetud hirsisuuruste sõlmedega, mida ümbritsevad harjataolised kõrgendused. Armi limaskestal (mõnikord põiel) on sarnased hemorraagiad ja sakiliste servadega sõlmekesed, samuti väikesed haavandid, mille keskosa on sissevajunud roosakas. Paapulides saab tuvastada elementaarseid kehasid, nagu Pascheni kehad, millel on diagnostiline väärtus äigepreparaadi mikroskoopial sukeldamisel läbi tavalise valgusmikroskoobi.

Diagnoos põhineb kliiniliste ja episootiliste andmete analüüsil (võttes arvesse kaamelite nakatumise võimalust inimestelt), patoloogilistel muutustel, mikroskoopia positiivsetel tulemustel (värskete papulade määrde töötlemisel Morozovi hõbemeetodil) või elektronoskoopial, samuti rõugetele vastuvõtlike loomade biotestid. Viirust on võimalik isoleerida rõugetega kaamelite aborteerunud loodete elunditest. Rõugete diagnoosimisel on soovitatav kasutada ka difusioonisadestamise reaktsiooni agargeelis ja neutraliseerimisreaktsiooni aktiivsete spetsiifiliste seerumite või globuliinide juuresolekul.

Diferentsiaaldiagnostika viiakse läbi kahtlastel juhtudel (võttes arvesse kliinilisi ja episootilisi tunnuseid). Rõuged tuleb eristada nekrobakterioosist patoloogilisest materjalist saadud määrde mikroskoopia ja sellele vastuvõtlike valgete hiirte nakatumise teel; suu- ja sõrataudist - merisigade nakatumine patoloogilise materjali suspensiooniga tagajalgade naha tallapinnas; seennakkustest ja kärntõvest - uuritud naha kahjustatud piirkondadelt võetud kaapimistest vastavate haigustekitajate leidmisega; brutselloosist abortide, nurisünnituste ja enneaegsete varssade ajal - RA ja RSK kaamelite vereseerumi uurimisega ning loodete bakterioloogilise uuringuga mikroobikultuuri eraldamisega toitesöötmel ja mikroskoopiaga (vajadusel kasutada merisigadel biotesti, millele järgneb vere ja seerumi bakterioloogilised ja seroloogilised uuringud).

Rõugete diagnoosimisel kaamelitel tuleb välistada ka mittenakkav, kuid mõnikord laialt levinud haigus, mis esineb huulte ja nina nahakahjustustega - yantak-bash (türkm.), Jantak-bas (kasahhi), mis tekib alates nende vigastamine kaameli okasteks kutsutud põõsaste (yantak, jantak, Alhagi) söömisel. Tavaliselt võib seda haigust sügisel täheldada noortel, peamiselt alla üheaastastel kaamelitel. Täiskasvanud kaameleid mõjutab kaameli okas vaid veidi. Yantak-bashi puhul ei esine erinevalt rõugetest suu limaskestal tavaliselt sõlmesid ega papulaarseid kahjustusi. Yantak-bashiga tekkivat hallikat katet on suhteliselt lihtne eemaldada. Siiski tuleb arvestada, et yantak-bash soodustab kaamelite rõugete haigust ja kulgeb sageli sellega samaaegselt.

Rõugeviiruse isoleerimisel on vaja määrata selle tüüp (originaal, lehmarõuge või vaktsiinia), kasutades selleks ENSV Tervishoiuministeeriumi 1968. aasta juhendis toodud meetodeid. Lehmarõugete ennetamise kohta inimestel, andmed, mis on saadud pärast infektsioon (isoleeritud tingimustes) kaamelitel, kellel oli olnud rõugevaktsiini viirus ja isoleeritud patogeenid.

Haigete kaamelite ravi on peamiselt sümptomaatiline. Mõjutatud piirkondi töödeldakse kaaliumpermanganaadi lahusega (1:3000) ja pärast kuivatamist määritakse 10% joodi ja glütseriini tinktuuri (1:2 või 1:3) seguga. Pärast rõugete avamist töödeldakse seda süntomütsiini 5% emulsiooniga rikastatud kalaõlil, millele lisatakse joodi tinktuuri vahekorras 1:15-1:20; salvid - tsink, ihtiool, penitsilliin jne Vaseliinil võib kasutada 2% salitsüül- või boorsalvi ja 20-30% taruvaigu salvi. Kuuma ilmaga on näidatud 3% kreoliini salvi, tõrva ja heksakloraani tolmu. Mõjutatud piirkondi määritakse 2-3 korda päevas emulsioonides ja salvides leotatud tampoonidega.

Mõjutatud suu limaskesta pestakse 2-3 korda päevas 10% kaaliumpermanganaadi lahusega või 3% vesinikperoksiidi lahusega või salvei, kummeli ja muude desinfektsiooni- ja kokkutõmbavate ainete keetmisega. Konjunktiviidi korral pestakse silmi 0,1% tsinksulfaadi lahusega.

Sekundaarse mikroobse infektsiooni tekke ja võimalike tüsistuste vältimiseks on soovitatav süstida penitsilliini ja streptomütsiini intramuskulaarselt. Üldise nõrkuse ja tüsistuste korral on näidustatud südameravi.

Spetsiifiliste ravivahendite hulgast haiguse rasketel juhtudel võite kasutada rõugete põdenud kaamelite seerumit või verd (subkutaanselt 1-2 ml 1 kg looma kaalu kohta). Süstekohad lõigatakse eelnevalt hoolikalt välja ja pühitakse jooditinktuuriga.

Haigetele ja kosuvatele kaamelitele antakse sageli puhast vett, klii- või odrajahu puderit, pehmet siniheina või peent lutserni heina või odrajahuga maitsestatud puuvillakestasid. Külma ilmaga hoitakse haigeid loomi, eriti kaameleid, puhtas, kuivas ja soojas ruumis või kaetuna tekkidega.

Looduslikult haigete rõugekaamelite immuunsus püsib kuni 20-25 aastat, see tähendab peaaegu kogu elu. Immuunsuse olemus on naha-humoraalne, millest annab tunnistust neutraliseerivate antikehade olemasolu taastunud loomade vereseerumis ja kaamelite resistentsus homoloogse rõugeviirusega nakatumise suhtes. Kaamelid, kes on sündinud rõugetest põdenud kaamelitest, ei ole vastuvõtlikud kaamelil esinenud rõugete tüübile, eriti esimesel kolmel aastal, st kuni puberteedieani. Kaamelivasikad, kes on episootiaperioodil emaka all, reeglina rõugetesse ei haigestu ega haigestu suhteliselt kergesti ja lühiajaliselt.

Ennetus- ja kontrollimeetmed on kõigi veterinaar-, sanitaar- ja karantiinimeetmete range järgimine, haiguse õigeaegne diagnoosimine ja viiruse tüübi määramine. Inimestel ei tohiks lubada vaktsineerimise ajal ja vaktsineerimisjärgsel perioodil kaameleid hooldada enne, kui neil (või nende lastel) on kliiniliselt väljendunud reaktsioon rõugete vaktsineerimisele täielikult lõppenud. Kõiki farmi sisenevaid kaameleid, lehmi ja hobuseid tuleb hoida 30 päeva isolatsioonikambris.

Rõugete ilmnemisel kaamelite, lehmade ja hobuste seas tunnistatakse rajooni täitevkomitee eriotsusega piirkond, asula või rajoon, karjamaa, kus see haigus leiti, rõugete suhtes ebasoodsaks ning rakendatakse karantiini, piiravad ja tervisekaitsemeetmed.

Rõugete ilmnemisest teavitatakse viivitamatult kõrgemaid veterinaarorganisatsioone, naaberfarme ja piirkondi, et nad võtaksid kasutusele asjakohased meetmed haiguse edasise leviku tõkestamiseks.

Kaamelite lehmarõugetesse nakatumise vältimiseks on soovitatav kasutada meditsiinilist preparaati - rõugedetrit, mida kasutatakse kõigi kliiniliselt tervete kaamelite immuniseerimiseks, sõltumata nende vanusest, soost ja füsioloogilisest seisundist (tiinedus ja imetavad kaamelid) ebasoodsas olukorras olevatel ja ohustatud lehmarõugefarmid. Selleks lõigatakse kaameli kaela alumisest kolmandikust vill välja, töödeldakse alkoholeetriga või 0,5% karboolhappe lahusega, pühitakse vatiga kuivaks või kuivatatakse, nahk skaritakse ja kantakse jämeda nõelaga, skalpelli või kobesti ots 2-3 madalat paralleelset kriimustust 2 pikkusega -4 cm Värskelt skarifitseeritud nahapinnale kantakse 3-4 tilka lahustunud vaktsiini ja hõõrutakse kergelt spaatliga. Lahustage vaktsiin ampullide ja ampullide karpide etiketil näidatud viisil. Lahjendatud ja kasutamata vaktsiin ja vaktsiiniampullid desinfitseeritakse keetmise teel ja hävitatakse. Vaktsineerimiseks kasutatavad tööriistad pestakse 3% karboolhappe lahusega või 1% formaldehüüdi lahusega ja steriliseeritakse keetmisega.

Kui kaamel ei olnud lehmarõugete suhtes immuunne, peaksid 5–7. päeval pärast vaktsineerimist skarifikatsiooni kohale ilmuma papulid. Kui neid ei ole, korratakse vaktsineerimist, kuid kaela vastaspoolel ja erineva seeria vaktsiiniga. Rõugete vastu immuunsed ja isikliku hügieeni reegleid tundvad isikud võivad hoolitseda immuniseeritud ja haigete kaamelite eest. Noored loomad, eriti nõrgast rühmast, võivad mõnikord vaktsineerimisele tugevalt reageerida ja haigestuda väljendunud rõugete tunnustega.

Haiged ja tugevalt reageerivad kaamelid isoleeritakse ja ravitakse (vt eespool). Loomahooned ja rõugeviirusega saastunud kohad on soovitatav desinfitseerida kuumade 2-4% seebikivi ja seebikivi lahusega, 3% väävel-karboolsegu lahusega või 2-3% väävelhappe lahustega või selitatud lahustega. valgendi, mis sisaldab 2-6% aktiivset kloori, mis inaktiveerib rõugeviiruse 2-3 tunni jooksul (O. Trabaev, 1970). Võite kasutada ka 3-5% klooramiini ja 2% formaldehüüdi lahust. Sõnnik tuleb põletada või biotermiliselt desinfitseerida. Rõugete kliiniliste tunnustega kukkunud kaamelite surnukehad tuleb põletada. Haigete ja rõugete kahtlusega kaamelite piima, kui see ei sisalda mäda lisandeid ega ole muul põhjusel vastunäidustatud, võib süüa alles pärast 5-minutilist keetmist või pastöriseerimist 85–30 minutit. Rõugefarmide hädas hukkunud kaamelite villa ja nahka töödeldakse vastavalt loomse päritoluga tooraine desinfitseerimise juhendile.

Rõugetele ebasoodsad piirangud taludelt ja asulatelt on soovitatav eemaldada mitte varem kui 20 päeva pärast kõigi rõugetesse haigestunud loomade ja inimeste paranemist ning pärast põhjalikku lõppdesinfitseerimist.

134. Viiruste keemiline koostis ja biokeemilised omadused

1.1 Virioonide struktuur ja keemiline koostis.

Suurimad viirused (rõugeviirused) on oma suuruselt lähedased bakterite väiksusele, väikseimad (entsefaliidi, poliomüeliidi, suu- ja sõrataudi tekitajad) vere hemoglobiinimolekulidesse suunatud suurtele valgumolekulidele. Teisisõnu, viiruste hulgas on hiiglased ja kääbused. Viiruste mõõtmiseks kasutatakse tingimuslikku väärtust, mida nimetatakse nanomeetriks (nm). Üks nm on miljondik millimeetrist. Erinevate viiruste suurused varieeruvad vahemikus 20 kuni mitusada 1 nm.

Lihtsad viirused koosnevad valkudest ja nukleiinhapetest. Viiruseosakese kõige olulisem osa, nukleiinhape, on geneetilise informatsiooni kandja. Kui inimeste, loomade, taimede ja bakterite rakud sisaldavad alati kahte tüüpi nukleiinhappeid - desoksüribonukleiinhappe DNA ja ribonukleiinhappe RNA, siis erinevates viirustes leiti ainult ühte tüüpi kas DNA või RNA, mis on nende klassifitseerimise aluseks. Virioni teine ​​kohustuslik komponent, valgud erinevad erinevate viiruste poolest, mis võimaldab neid ära tunda immunoloogiliste reaktsioonide abil.

Keerulisema ehitusega viirused sisaldavad lisaks valkudele ja nukleiinhapetele süsivesikuid ja lipiide. Igal viiruste rühmal on oma valkude, rasvade, süsivesikute ja nukleiinhapete komplekt. Mõned viirused sisaldavad ensüüme. Virioonide igal komponendil on teatud funktsioonid: valgukest kaitseb neid kahjulike mõjude eest, nukleiinhape vastutab pärilike ja nakkavate omaduste eest ning mängib juhtivat rolli viiruste varieeruvuses ning ensüümid osalevad nende paljunemises. Tavaliselt asub nukleiinhape virioni keskel ja seda ümbritseb valgukest (kapsiid), mis on justkui sellesse riietatud.

Kapsiid koosneb teatud viisil paigutatud sarnastest valgu molekulidest (kapsomeeridest), mis moodustavad viiruse nukleiinhappega (nukleokapsiidiga) paigas sümmeetrilisi geomeetrilisi kujundeid. Nukleokapsiidi kuubisümmeetria korral on nukleiinhappe ahel keritud palliks ja kapsomeerid on selle ümber tihedalt pakitud. Nii levivad lastehalvatuse, suu- ja sõrataudi viirused jne.

Nukleokapsiidi spiraalse (pulgakujulise) sümmeetriaga on viiruse niit keerdunud spiraali kujul, iga selle mähis on kaetud kapsomeeridega, mis on üksteisega tumedalt külgnevad. Kapsomeeride struktuuri ja virioonide välimust saab jälgida elektronmikroskoopia abil.

Enamik viirusi, mis põhjustavad inimestel ja loomadel infektsioone, on kuubisümmeetria tüüpi. Kapsiidil on peaaegu alati ikosaeedriline korrapärane kahekümnetahuline heksaeedr, millel on kaksteist tippu ja võrdkülgsete kolmnurkade tahud.

Paljudel viirustel on lisaks valgukapsiidile ka välimine kest. Lisaks viirusvalkudele ja glükoproteiinidele sisaldab see ka peremeesraku plasmamembraanilt laenatud lipiide. Gripiviirus on näide spiraalsest ümbrisega virionist, millel on kuupmeetri sümmeetriatüüp.

Viiruste kaasaegne klassifikatsioon põhineb nende nukleiinhappe tüübil ja kujul, sümmeetria tüübil ning väliskesta olemasolul või puudumisel.

Biokeemilised omadused – vt. manuaal!!!

135. Elundite tükid, mis säilitavad funktsionaalse ja vohava aktiivsuse in vitro

Rakukultuur

mis tahes loomse koe rakud, mis on võimelised kasvama monokihina tehistingimustes spetsiaalse toitekeskkonnaga täidetud klaas- või plastpinnal. Rakkude allikas on värskelt saadud loomkude - esmased rakud, laboratoorsed rakutüved - siirdatud to-ry. rakud. Embrüonaalsetel ja kasvajarakkudel on parim võime kasvada tehistingimustes. Inimese ja ahvi rakkude diploidne to-ra passeeritakse piiratud arv kordi, seetõttu nimetatakse seda mõnikord nn. poolsiirdatav rakkude sülem. Lahtrite vastuvõtmise etapid: allika purustamine; trüpsiini ravi; vabanemine detritusest; antibiootikumidega toitekeskkonnas suspendeeritud rakkude arvu standardimine; valatakse katseklaasidesse või viaalidesse, milles rakud settivad seintele või põhjale ja hakkavad paljunema; kontroll monokihi moodustumise üle. To-ry rakke kasutatakse viiruse isoleerimiseks uuringust. materjal, viiruse suspensiooni kogunemiseks, St in. Viimasel ajal on seda kasutatud bakterioloogias.

136. Parasteesiad. Mis see on?

PARESTESIA(kreeka keelest para-lähedane, vastupidine ja aisthesis-sensatsioon), mida mõnikord nimetatakse ka düsesteesiaks, mida ei põhjusta välisärritus, tuimus, kipitustunne, hanenahk (myrmeciasis, myrmecismus, formicatio), põletustunne, sügelus, valulik külmetus (st n. psühroesteesia), liigutused jne, aistingud ilmselt säilinud jäsemetes amputeeritutel (pseudomelia paraesthetica). P. põhjused võivad olla erinevad. P. võib tekkida lokaalsete muutuste tagajärjel vereringes, Renaudi tõvega, erütromelalgiaga, akroparesteesiaga, endarteriidiga, spontaanse gangreeni esialgse sümptomina. Mõnikord esinevad need närvisüsteemi kahjustuse, traumaatilise neuriidiga (vrd tüüpiline P. ulnaris'e verevalumiga sulcus olecrani piirkonnas), toksilise ja nakkusliku neuriidiga, radikuliidiga, seljaaju pahhümeningiidiga (kompressioon). juured), äge ja kroon. müeliit, eriti seljaaju kokkusurumisel (seljaaju kasvajad) ja tabes dorsalisega. Nende diagnostiline väärtus on kõigil neil juhtudel sama, mis valu, anesteesia ja hüperesteesia diagnostiline väärtus: esinedes teatud piirkondades, piki ühe või teise perifeerse närvi trakti või ühe või teise radikulaarse innervatsiooni piirkonnas, võivad nad esineda. annab väärtuslikku teavet patoloogia asukoha kohta. protsessi. Esemed on võimalikud ka ajukahjustuse ilminguteks. Niisiis algavad kortikaalse epilepsia korral krambid sageli P.-ga, mis paikneb jäsemetes, millest seejärel algavad krambid. Sageli täheldatakse neid ka ajuarterioskleroosi või aju süüfilise korral ja mõnikord on need apoplektilise insuldi esilekutsujad. vaimne P., st psühhogeense, hüpohondriaalse päritoluga P., millele on eriti iseloomulik, et neil pole elementaarne, nagu orgaaniline, vaid kompleksne iseloom - "usside roomamine peanaha alla", "palli kõhust tõstmine". kaelani” (Oppenheim) jne. Nende diagnostiline väärtus on loomulikult täiesti erinev orgaanilise P omast

137. Viirust sisaldava materjaliga töötamise ja ohutusabinõude reeglid

138. Veiste nakkusliku rinotrahheiidi viirus

Nakkuslik rinotrahheiit(lat. - Rhinotracheitis infectiosa bovum; inglise - Infectious bovine rhinotracheites; IRT, villiline lööve, infektsioosne vulvovaginiit, nakkav riniit, "punane nina", ülemiste hingamisteede nakkuslik katarr) on veiste äge nakkav haigus, mida iseloomustab peamiselt katarraal. hingamisteede nekrootilised kahjustused, palavik, üldine depressioon ja konjunktiviit, samuti pustuloosne vulvovaginiit ja abort.

IRT põhjustaja - Herpesvirus bovis 1, kuulub herpesviiruste perekonda, DNA-d sisaldav, virioni läbimõõt on 120 ... 140 nm. Selle viiruse 9 struktuurvalku on eraldatud ja iseloomustatud.

RTI viirust kasvatatakse kergesti paljudes rakukultuurides, põhjustades CPP-d. Viiruse paljunemisega kaasneb mitootilise rakkude jagunemise pärssimine ja tuumasiseste inklusioonide moodustumine. Sellel on ka hemaglutineerivad omadused ja tropism hingamis- ja reproduktiivorganite rakkudele ning see võib migreeruda limaskestadelt kesknärvisüsteemi, on võimeline nakatama loodet raseduse esimese ja teise poole lõpus.

Temperatuuril -60 ... -70 "C elab viirus 7 ... 9 kuud, 56 ° C juures inaktiveeritakse 20 minuti pärast, 37 ° C juures - 4 ... 10 päeva pärast, 22 ° C juures - 50 päeva pärast. Kell 4 " Koos viiruse aktiivsus väheneb veidi. Külmutamine ja sulatamine vähendab selle virulentsust ja immunogeenset aktiivsust.

Formaliini lahused 1: 500 inaktiveerivad viiruse 24 tunni pärast, 1: 4000 - 46 tunni pärast, 1: 5000 - 96 tunni pärast.Happelises keskkonnas kaotab viirus kiiresti oma aktiivsuse, püsib kaua (kuni 9). kuud) pH tasemel 6,0 ... 9,0 ja temperatuuril 4 °C. Viiruse ellujäämise kohta on andmeid kuivjää temperatuuril 4 ... 12 kuud ja vedelas lämmastikus - 1 aasta hoitud pullide spermas. Viiruse inaktiveerimise võimalus pullide spermas ilmnes, kui seda töödeldi 0,3% trüpsiini lahusega.

Nakkuse tekitaja allikad on haiged loomad ja varjatud viirusekandjad. Pärast virulentse tüvega nakatumist muutuvad kõik loomad viiruse varjatud kandjateks. Härjad-tootjad on väga ohtlikud, sest pärast haigestumist eritavad nad viirust 6 kuud ja võivad lehmi paaritumisel nakatada. Viirus satub keskkonda ninasekreediga, eritistega silmadest ja suguelunditest, piima, uriini, väljaheidete ja spermaga. Arvatakse, et gnuud on RTI viiruse reservuaariks Aafrika riikides. Lisaks võib viirus paljuneda puukides, mis mängivad olulist rolli veiste haiguse tekitamisel.

Viiruse edasikandumise tegurid on õhk, sööt, sperma, sõidukid, hooldusvahendid, linnud, putukad, aga ka inimesed (talutöötajad). Nakkusviisid - kontakt, õhus, ülekantav, toidu kaudu.

Vastuvõtlikud loomad on veised olenemata soost ja vanusest. Kõige raskem on haigus lihaveistel. Katses õnnestus nakatada lambaid, kitsi, sigu ja hirvi. Loomad haigestuvad tavaliselt 10...15 päeva pärast düsfunktsionaalsesse farmi sattumist.

RTI esinemissagedus on 30...100%, suremus - 1...15%, võib olla suurem, kui haigust komplitseerivad teised hingamisteede infektsioonid.

Esmastes fookustes mõjutab haigus peaaegu kogu karilooma, samas kui suremus ulatub 18% -ni. IRT esineb sageli tööstuslikku tüüpi farmides erinevatest farmidest toodud loomarühmade komplekteerimisel.

Kui see siseneb hingamisteede või suguelundite limaskestadele, tungib viirus epiteelirakkudesse, kus see paljuneb, põhjustades nende surma ja ketendust. Seejärel tekivad hingamisteede limaskesta pinnale haavandid ning suguelunditesse tekivad sõlmed ja pustulid. Primaarsetest kahjustustest siseneb viirus õhuga bronhidesse ja ülemistest hingamisteedest konjunktiivi, kus see põhjustab kahjustatud rakkudes degeneratiivseid muutusi, mis kutsub esile keha põletikulise reaktsiooni. Seejärel adsorbeerub viirus leukotsüütidele ja levib lümfisõlmede kaudu ning sealt edasi verre. Vireemiaga kaasneb looma üldine depressioon, palavik. Vasikatel võib viirus verega kanduda parenhüümsetesse organitesse, kus see paljuneb, põhjustades degeneratiivseid muutusi. Kui viirus läbib hematoentsefaal- ja platsentaarbarjääri, ilmnevad patoloogilised muutused ajus, platsentas, emakas ja lootes. Patoloogiline protsess sõltub suuresti ka mikrofloora põhjustatud tüsistustest.

Inkubatsiooniperiood on keskmiselt 2-4 päeva, väga harva rohkem. Põhimõtteliselt on haigus äge. IRT-l on viis vormi: ülemiste hingamisteede infektsioonid, vaginiit, entsefaliit, konjunktiviit ja artriit.

Hingamisorganite kahjustusega on võimalik krooniline seroos-mädane kopsupõletik, millesse sureb umbes 20% vasikatest. Suguelundite vormis on kahjustatud välissuguelundid, lehmadel tekib mõnikord endometriit, isadel orhiit, mis võib põhjustada viljatust. Kunstlikuks viljastamiseks kasutatavatel pullidel avaldub IRT korduva dermatiidina kõhukelmes, tuharatel, päraku ümbruses, mõnikord sabal, munandikotti. Viirustega nakatunud sperma võib lehmadel põhjustada endometriiti ja viljatust.

Aborte ja loote surma emakas täheldatakse 3 nädalat pärast nakatumist, mis langeb kokku antikehade tiitri tõusuga tiinete taastuvate lehmade veres, mille olemasolu ei takista aborte ja loote surma emakas.

Täheldati IRT tendentsi varjatud kulgemisele suguelundite vorm. Tupe limaskesta epiteelis, selle vestibüülis ja häbemas moodustub arvukalt erineva suurusega pustuleid (pustuloosne vulvovaginiit). Nende asemele ilmuvad erosioonid ja haavandid. Pärast haavandiliste kahjustuste paranemist jäävad limaskestale pikaks ajaks hüpereemilised sõlmed. Haigete pullide puhul on protsess lokaliseeritud eesnahale ja peenisele. Iseloomulik on pustulite ja vesiikulite moodustumine. Väikesel osal tiinetest lehmadest on võimalikud abordid, loote resorptsioon või enneaegne poegimine. Aborditud loomadel oli reeglina varem olnud rinotrahheiit või konjunktiviit. Aborditud lehmade hulgas ei ole välistatud metriidist ja loote lagunemisest tingitud surmavad tagajärjed. Harvad pole aga abortide juhtumid, kui lehma emaka limaskestal pole põletikulisi protsesse. IRT puhul esineb ägeda mastiidi juhtumeid. Udara on järsult põletikuline ja suurenenud, palpatsioonil valulik. Piimatoodang väheneb järsult.

Kell meningoentsefaliit koos rõhumisega täheldatakse motoorsete funktsioonide häireid ja tasakaalustamatust. Haigusega kaasneb lihaste värisemine, madalseis, hammaste krigistamine, krambid, süljeeritus. See haigusvorm mõjutab peamiselt 2–6 kuu vanuseid vasikaid.

Hingamisteede vorm infektsioonile on iseloomulik kehatemperatuuri järsk tõus kuni 41 ... 42 °C, nina limaskesta, ninaneelu ja hingetoru hüpereemia, depressioon, kuiv valulik köha, rohke seroos-limaskesta eritis ninast (nohu) ja vahune süljeeritus. Haiguse arenedes muutub lima paksuks, hingamisteedesse tekivad limakorgid ja nekroosikolded.Raske haiguse korral täheldatakse lämbumisnähte.Hüpereemia ulatub ninapeeglini ("punane nina"). IRT viirus noorveiste massilise keratokonjunktiviidi korral on tõestatud. Noorveistel avaldub haigus mõnikord ka entsefaliit. See algab äkilise erutuse, mässu ja agressiooniga, liigutuste koordineerimise halvenemisega. Kehatemperatuur on normaalne. Noortel vasikatel põhjustavad mõned RTI viiruse tüved ägedat seedetrakti haigust.

Üldiselt on haigetel loomadel hingamisvorm kliiniliselt selgelt väljendunud, suguelundite vorm jääb sageli märkamatuks.

Ägedas respiratoorses vormis hukkunud või surnud loomade lahkamisel avastatakse tavaliselt seroosse konjunktiviidi, katarraal-mädase riniidi, larüngiidi ja trahheiidi tunnused, samuti adnexaalõõnte limaskestade kahjustused. Turbinaatide limaskest on turse ja hüpereemiline, kaetud limaskestade mädase kattekihiga. Kohati ilmnevad erineva kuju ja suurusega erosioonikahjustused. Mädane eksudaat koguneb nina- ja adnexaalsetesse õõnsustesse. Kõri ja hingetoru limaskestadel petehhiaalsed hemorraagid ja erosioonid. Rasketel juhtudel toimub hingetoru limaskestal fokaalne nekroos, surnud loomadel on võimalik bronhopneumoonia. Kopsudes on atelektaaside fookuspiirkonnad. Kahjustatud piirkondade alveoolide ja bronhide luumen on täidetud seroos-mädase eksudaadiga. Interstitsiaalse koe tugev turse. Kui silmad on mõjutatud, on silmalau konjunktiiv hüpereemiline, turse, mis ulatub ka silmamuna sidekestani. Konjunktiiv on kaetud rasvase naastuga. Sageli moodustuvad sellele umbes 2 mm suurused papillaarsed mugulad, väikesed erosioonid ja haavandid.

Suguelundite vormis on tupe ja häbeme tugevalt põletikulisel limaskestal erinevatel arenguetappidel näha mädapaiste, erosioone ja haavandeid. Lisaks vulvovaginiidile võib avastada serokatarraalset või mädast tservitsiiti, endometriiti ja palju harvem proktiiti. Isadel liituvad rasketel juhtudel fimoos ja parafimoos pustuloosse balanopostiidiga.

Värsked aborteeritud looted on tavaliselt tursed, väikeste autolüütiliste nähtustega. Väikesed hemorraagiad limaskestadel ja seroosmembraanidel. Pärast loote surma pikema aja möödudes on muutused raskemad; lihastevahelises sidekoes ja kehaõõnsustesse koguneb tumepunane vedelik, parenhüümsetes organites - nekroosikolded.

Udara mõjutamisel avastatakse seroos-mädane difuusne mastiit. Lõikepind on turse, kahjustatud sagarate suurenemise tõttu selgelt granuleeritud. Vajutades voolab sellest hägune mädane saladus. Paagi limaskest on hüpereemiline, paistes, hemorraagiaga. Aju entsefaliidi korral tuvastatakse veresoonte hüperemia, kudede turse ja väikesed hemorraagiad.

IRT diagnoositakse kliiniliste ja epizootoloogiliste andmete, elundite ja kudede patoloogiliste muutuste põhjal koos kohustusliku kinnitusega laboratoorsete meetoditega. Varjatud infektsioon tuvastatakse ainult laboratoorsete testidega.

Laboratoorne diagnostika hõlmab: 1) viiruse eraldamist patoloogilisest materjalist rakukultuuris ja selle tuvastamist RN-is või RIF-is; 2) RTI viiruse antigeenide tuvastamine patoloogilises materjalis RIF-i abil; 3) antigeenide tuvastamine haigete ja tervenenud loomade vereseerumis (retrospektiivne diagnoos) RN-is või RIGA-s.

Viroloogiliseks uuringuks võetakse haigetelt loomadelt lima ninaõõnest, silmadest, tupest, eesnahast; sunniviisiliselt tapetult ja langenutelt - nina vaheseina, hingetoru, kopsu, maksa, põrna, aju, piirkondlike lümfisõlmede tükid, mis võetakse hiljemalt 2 tundi pärast surma. Vere seerumit võetakse ka retrospektiivse seroloogilise diagnoosi jaoks. Laboratoorseks diagnostikaks IRT kasutada veiste IRT-diagnostika komplekti ja erütrotsüütide diagnostikakomplekti infektsiooni serodiagnostikaks RIGA-s.

IRT diagnoosimine toimub paralleelselt paragripi-3, adenoviirusnakkuse, respiratoorse süntsütiaalse infektsiooni ja viirusliku kõhulahtisuse materjali uurimisega.

IRT esialgne diagnoos veistel tehakse patoloogilises materjalis antigeeni tuvastamise positiivsete tulemuste põhjal, kasutades REEF võttes arvesse epizootoloogilisi ja kliinilisi andmeid, samuti patoloogilisi muutusi. Lõplik diagnoos tehakse RIF-i tulemuste kokkulangevuse alusel viiruse eraldamise ja tuvastamisega.

Nakkusliku rinotrahheiidi diferentsiaaldiagnostikas on vaja välistada suu- ja sõrataud, pahaloomuline katarraalne palavik, paragripp-3, adenoviirus- ja klamüüdiainfektsioonid, viiruslik kõhulahtisus, respiratoorne süntsütiaalne infektsioon, pastörelloos.

Haigusega kaasneb püsiv ja pikaajaline immuunsus, mis võib ternespiima antikehadega järglastele edasi anda. Tervenenud loomade immuunsus püsib vähemalt 1,5...2 aastat, kuid isegi väljendunud humoraalne immuunsus ei takista viiruse püsimist taastuvatel loomadel ning neid tuleks käsitleda kui potentsiaalset nakkusallikat teistele loomadele. Seetõttu tuleks kõiki loomi, kellel on RTI-vastased antikehad, pidada varjatud viiruse kandjateks.

139. Arenevate linnuembrüote toitainete reservuaar on

Arvestades lindude embrüogeneesi keerulist ja üsna pikka protsessi, on vaja moodustada spetsiaalsed ajutised embrüonaalsed ajutised elundid. Esimene neist moodustab munakollase ja seejärel ülejäänud ajutised elundid: amnionimembraan (amnion), seroosmembraan, allantois. Varasemas evolutsioonis leiti munakollane ainult tuuradel, kellel on teravalt teloletsitaalne rakk ja embrüogeneesi protsess on keeruline ja pikk. Rebukoti moodustumise ajal täheldatakse munakollase saastumist lehtede osadega, mida me nimetame ekstraembrüonaalseteks lehtedeks või ekstraembrüonaalseks materjaliks. Kuid ekstraembrüonaalne endoderm hakkab kasvama munakollase serval. Embrüonaalne mesoderm on kihistunud kaheks kihiks: vistseraalne ja parietaalne, samas kui vistseraalne leht külgneb embrüovälise endodermiga ja parietaalne - embrüovälise ektodermiga.

Embrüonaalne ektoderm lükkab valgu kõrvale ja kasvatab ka munakollase üle. Järk-järgult ümbritseb munakollane mass täielikult embrüonaalsest endodermist ja embrüovälise mesodermi vistseraalsest lehest koosneva seinaga – moodustub esimene ajutine elund, munakollane.

Munakollase funktsioonid. Rebukoti endodermirakud hakkavad eritama hüdrolüütilisi ensüüme, mis lagundavad munakollase massi. Lõhusaadused imenduvad ja transporditakse läbi veresoonte embrüosse. Nii et munakollane tagab troofilise funktsiooni. Vistseraalsest mesodermist moodustuvad esimesed veresooned ja esimesed vererakud ning seetõttu täidab munakollane ka hematopoeetilist funktsiooni. Lindudel ja imetajatel leitakse munakollase rakkude hulgast varakult suguelundite punga, gonoblasti rakud.

140. Taasaktiveerimine. Mis see on?

Genotüüpi muutes jagatakse mutatsioonid punkt- (lokaliseerub üksikutes geenides) ja geenideks (mõjutavad genoomi suuremaid alasid).
Tundlike rakkude viirusnakkus on oma olemuselt mitmekordne, s.t. rakku siseneb korraga mitu virioni. Sel juhul võivad replikatsiooniprotsessis olevad viiruse genoomid koostööd teha või segada. Viiruste vahelisi koostoimeid esindavad geneetiline rekombinatsioon, geneetiline taasaktiveerimine, komplementatsioon ja fenotüübiline segunemine.
Geneetiline rekombinatsioon esineb sagedamini DNA-d sisaldavates viirustes või fragmenteeritud genoomiga RNA-d sisaldavates viirustes (gripiviirus). Geneetilise rekombinatsiooni käigus toimub vahetus viirusgenoomide homoloogsete piirkondade vahel.
Erinevate geenide mutatsioonidega seotud viiruste genoomide vahel täheldatakse geneetilist reaktivatsiooni. Geneetilise materjali ümberjagamisel moodustub täisväärtuslik genoom.
Komplementatsioon toimub siis, kui üks rakku nakatavatest viirustest sünteesib mutatsiooni tulemusena mittefunktsionaalse valgu. Metsiktüüpi viirus, mis sünteesib terviklikku valku, korvab selle puudumise mutantses viiruses.

Sõltuvalt valmistamismeetodist jaotatakse rakukultuurid järgmisteks osadeks:

- ühekihiline– rakud on võimelised kinnituma ja paljunema keemiliselt neutraalse klaasi või plasti pinnal.

- peatamine- rakud paljunevad kogu toitainekeskkonnas, kui seda segatakse.

- orel- terved elundite ja kudede tükid, mis säilitavad esialgse struktuuri väljaspool keha (piiratud kasutamine).

Kõige levinumad on ühekihilised rakukultuurid, mis võib jagada olenevalt elujõuliste põlvkondade arvust

1) esmane (peamiselt trüpsiinitud),

2) poolsiirdatav (diploidne)

3) siirdatav.

Päritolu neid liigitatakse embrüonaalseteks, neoplastilisteks ja täiskasvanud organismideks.

Morfogeneesi järgi- fibroblastilistel, epiteelirakkudel jne.

Esmane rakukultuurid on mis tahes inimese või looma koe rakud, millel on võime kasvada monokihina spetsiaalse toitekeskkonnaga kaetud plast- või klaaspinnal. Selliste põllukultuuride eluiga on piiratud. Igal juhul saadakse need koest pärast mehaanilist jahvatamist, töötlemist proteolüütiliste ensüümidega ja rakkude arvu standardiseerimist. Ahvide neerudest, inimese embrüonaalsetest neerudest, inimese lootevetest ja kanaembrüotest saadud primaarseid kultuure kasutatakse laialdaselt viiruse eraldamiseks ja akumuleerimiseks, samuti viirusvaktsiinide tootmiseks.

poolsiirdatav(või diploidne ) rakukultuurid – sama tüüpi rakud, mis on võimelised taluma kuni 50–100 passaaži in vitro, säilitades samal ajal oma esialgse diploidse kromosoomikomplekti. Inimese embrüonaalsete fibroblastide diploidseid tüvesid kasutatakse nii viirusnakkuste diagnoosimiseks kui ka viirusvaktsiinide tootmiseks. Kõige sagedamini kasutatavad kultuurid on inimese embrüonaalsed fibroblastid (WI-38, MRC-5, IMR-9), lehmad, sead, lambad jne.

siirdatud rakuliinidele on iseloomulik potentsiaalne surematus ja heteroploidne kariotüüp. Primaarsed rakukultuurid võivad olla pidevate liinide allikaks(näiteks SOC - cinamobus ahvi süda, PES - sea embrüo neerud, VNK-21 - ühepäevaste Süüria hamstrite neerudest; PMS - merisea neerust, Vero - neer rohelise ahvi jne) üksikud rakud näitavad in vitro kalduvust lõputule paljunemisele. Muutuste kogumit, mis viivad selliste tunnuste ilmnemiseni rakkudest, nimetatakse transformatsiooniks ja siirdatud koekultuuride rakke nimetatakse transformeerituks. Teine siirdatavate rakuliinide allikas on pahaloomulised kasvajad. Sel juhul toimub raku transformatsioon in vivo. Viroloogilises praktikas kasutatakse kõige sagedamini järgmisi siirdatud rakkude ridu: HeLa - saadud emakakaela kartsinoomist; Ner-2 - kõri kartsinoomist; Detroit-6 - kopsuvähi metastaasidest luuüdi; RH - inimese neerust, KB - suuõõne kartsinoom, RD - inimese rabdomüosarkoom.

Organikultuurid- on steriilsetes tingimustes valmistatud loomaorganite lõigud, mis teatud aja (päevad, nädalad) säilitavad oma elutähtsa aktiivsuse spetsiaalsetes kultiveerimistingimustes

Levinumad on ühekihilised rakukultuurid, mida saab jagada primaarseteks (peamiselt trüpsiinitud), poolsiirdatavateks (diploidseteks), siirdatavateks, transfekteeritud.

Päritolu need jagunevad embrüonaalseteks, kasvajalisteks ja täiskasvanud organismideks; morfogeneesi teel- fibroblastilistel, epiteelirakkudel jne.

Esmane rakukultuurid on mis tahes inimese või looma koe rakud, mida saab kasvatada monokihina plast- või klaaspinnal spetsiaalses toitekeskkonnas, kuid mis ei ole võimelised pikaajaliseks paljunemiseks. Selliste põllukultuuride eluiga on piiratud. Igal juhul saadakse need koest pärast mehaanilist jahvatamist, töötlemist proteolüütiliste ensüümidega ja rakkude arvu standardiseerimist. Ahvide neerudest, inimese embrüonaalsetest neerudest, inimese lootevetest ja kanaembrüotest saadud primaarseid kultuure kasutatakse laialdaselt viiruse eraldamiseks ja akumuleerimiseks, samuti viirusvaktsiinide tootmiseks.

poolsiirdatav (diploidne ) rakukultuurid - sama genotüübi rakud, mis on võimelised taluma kuni 50-100 passaaži in vitro, säilitades samal ajal oma esialgse diploidse kromosoomikomplekti. Inimese embrüonaalsete fibroblastide diploidseid liine kasutatakse nii viirusnakkuste diagnoosimiseks kui ka viirusvaktsiinide tootmiseks.

siirdatud rakuliinidele on iseloomulik surematus ja heteroploidne kariotüüp. Siirdatud liinide allikaks võivad olla primaarsed rakukultuurid (näiteks SOC - ahvi südamest, PES - sea embrüo neerudest, VNK-21 - ühepäevaste Süüria hamstrite neerudest; PMS - merisea neerust jne), mille üksikutel rakkudel on leitud kalduvus in vitro lõputult paljuneda. Nimetatakse muutuste kogumit, mis viib selliste omaduste ilmnemiseni rakkudes muutumine ja siirdatud koekultuuride rakud - muudetud.

Teine pidevate rakuliinide allikas on pahaloomulised kasvajad. Sel juhul toimub raku transformatsioon in vivo. Viroloogilises praktikas on saadud ja enim kasutatud järgmised siirdatavad rakuliinid: HeLa – saadud emakakaela kartsinoomist; Hep-2 - kõri kartsinoomist; Detroit-6 - kopsuvähi metastaasidest luuüdi; RH - inimese neeru kasvajast.

Transfekteeritud rakukultuurid. Rakukultuuride katseliinid on välja töötatud pinnaantigeenide biosünteesi kontrollivate viiruse geenide transfektsiooni (siirdamise) teel. Sellised rakukultuurid ekspresseerivad kultuuri rakumembraanil teatud viiruse pinnavalku (HBs antigeen, gp120 jne). Selliseid rakukultuure kasutatakse viirusnakkuste patogeneesi immunoloogiliste mehhanismide uurimiseks, kemoterapeutiliste ja immunobioloogiliste ravimite väljatöötamiseks.

Kultiveeritud rakkude elulise aktiivsuse tagamiseks on vajalik kultuurimeedia . Kohtumisel jagatakse need kasvuks ja toetuseks. V kasvu Toitekeskkond peaks sisaldama rohkem toitaineid, mis tagavad rakkude aktiivse paljunemise ja monokihi moodustumise. Toetav söötmed tagavad rakkude ellujäämise juba moodustunud monokihis neis viiruste paljunemise perioodil.

Laialdaselt kasutatakse standardseid sünteetilisi kandjaid, nagu sünteetiline 199 kandja ja nõelkandja. Olenemata eesmärgist on kõik rakukultuuride toitesöötmed kujundatud tasakaalustatud soolalahuse baasil. Enamasti on see Hanki lahendus. Enamiku kasvusöötmete lahutamatuks komponendiks on loomade (vasikas, pull, hobune) vereseerum, mille 5-10% olemasoluta ei toimu rakkude paljunemist ja monokihi teket. Seerum ei kuulu hooldusvahendite hulka. Mikroorganismide võimaliku kasvu vältimiseks lisatakse toitekeskkonda antibiootikume.

Saada oma head tööd teadmistebaasi on lihtne. Kasutage allolevat vormi

Üliõpilased, magistrandid, noored teadlased, kes kasutavad teadmistebaasi oma õpingutes ja töös, on teile väga tänulikud.

postitatud http://www.allbest.ru/

rakuviiruse kultuur

Sissejuhatus

1. Rakukultuuride tüübid

2. Toiteainekeskkond

4.1 Viiruse tuvastamine

Bibliograafia

Sissejuhatus

Viiruste kvantitatiivseks akumuleerimiseks on kõige mugavam süsteem rakukultuurid. Esimesed katsed väljaspool keha loomarakke kasvatada pärinevad eelmise sajandi lõpust. Need fragmentaarsed vaatlused viitasid võimalusele säilitada kudede ja rakkude elujõulisust kunstlikes tingimustes ning tähistasid koekultuuride sügava teadusliku uurimistöö algust.

Suur teene kudede kultiveerimismeetodite väljatöötamisel kuulub Carrelile, kes tõestas esimesena loomarakkude paljunemise võimalikkust tehistingimustes ning demonstreeris sellega nende "surematust" ja sarnasust üherakuliste vabalt elavate organismidega. Earli juhitud teadlaste rühm on selles suunas teinud märkimisväärseid edusamme. Nad olid esimesed, kes saavutasid suure hulga rakkude kasvu klaasil ja vedelas segamissuspensioonis. Antibiootikumide tulek ja tehiskultuurisöötmete areng on toonud sisse uue ajastu koekultuuritehnikate arengus.

Koekultuure on pikka aega kasutatud erinevate bioloogia ja meditsiini probleemide lahendamiseks. Kuid ainult koekultuuride abil saavutatud edusammud viroloogia vallas olid võimsaks tõukejõuks nende arengule praegusele tasemele.

Viiruste kasvatamine aitab lahendada mitmeid teoreetilisi probleeme, mis on seotud "viiruse-raku" interaktsiooni omaduste uurimisega. Lisaks on paljude viirusnakkuste ennetamiseks mõeldud ravimite diagnoosimise ja tootmisega seotud rakendusprobleemide lahendamine võimatu ilma viirust sisaldavate toorainete kogunemiseta.

1. Rakukultuuride tüübid

Terve organismi rakkude ülekandmine elutingimustesse in vitro lõpetab nende eksisteerimise ühena arvukatest struktuurielementidest koes või elundis, millesse nad varem kuulusid. Sel juhul väljuvad rakud neurohumoraalsete tegurite kontrolli alt ja omandavad mitmeid tunnuseid, mis sõltuvad nii nendest kudedest pärit rakkude äratõukereaktsiooni faktist kui ka nende olemasolu spetsiifilistest tingimustest in vitro.

Väljaspool keha elavaid rakke või kudesid iseloomustab terve hulk metaboolseid, morfoloogilisi ja geneetilisi tunnuseid, mis erinevad järsult elundite ja kudede rakkude omadustest in vivo.

Sõltuvalt koe esmase eksplantatsiooni meetodist ja selle kasvatamise tehnikast eristatakse mitut tüüpi ellujäävaid ja kasvavaid koe- ja rakukultuure. Kõige laialdasemalt kasutatakse kasvavate rakkude ühekihilisi ja suspensioonkultuure. Need on kaasaegse labori- ja tööstusliku viroloogilise praktika aluseks.

Ühekihilisi rakukultuure on kahte peamist tüüpi: esmane ja siirdatud.

Mõiste "primaarne" viitab rakukultuurile, mis on saadud otse inimese või looma kudedest embrüonaalsel või postnataalsel perioodil. Selliste põllukultuuride eluiga on piiratud. Teatud aja pärast ilmnevad neis mittespetsiifilise degeneratsiooni nähtused, mis väljenduvad tsütoplasma granuleerimises ja vakuoliseerimises, rakkude ümardamises, side katkemises rakkude ja tahke substraadi vahel, millel neid kasvatati. Söötme perioodiline muutmine, viimase koostise muutmine ja muud protseduurid võivad vaid veidi pikendada primaarse rakukultuuri eluiga, kuid ei suuda ära hoida selle lõplikku hävimist ja surma. Suure tõenäosusega on see protsess seotud kogu organismis toimivate neurohumoraalsete tegurite kontrolli alt väljuvate rakkude metaboolse aktiivsuse loomuliku väljasuremisega.

Ainult populatsiooni üksikud rakud või rakurühmad võivad enamiku rakukihi degeneratsiooni taustal säilitada võime kasvada ja paljuneda. Need rakud, mis on leidnud lõputu paljunemisvõime in vitro, tekitavad pärast korduvaid inokulatsioone siirdatud rakukultuure.

Seal on siirdatud rakkude liine ja tüvesid. Esimene termin viitab siirdatavatele rakkudele, mida iseloomustab potentsiaalne surematus ja reeglina heteroploidne kariotüüp; teine ​​termin tähistab poolsiirdatavaid rakke, millel on diploidne kromosoomide komplekt ja piiratud eluiga in vitro. Nii nende kui ka teiste rakkude ilmumine on seotud primaarsete kultuuride rakupopulatsiooni selektsiooniprotsessiga, mis on seega kõigi siirdatud rakkude liinide ja tüvede allikas.

Siirdatavate rakuliinide peamine eelis võrreldes mis tahes primaarse kultuuriga on potentsiaal piiramatuks paljunemiseks väljaspool keha ja suhteline autonoomia, mis lähendab neid bakteritele ja üherakulistele algloomadele.

Siirdatud rakkude võime lõputult in vitro paljuneda tähistab kvalitatiivset hüpet, mille tulemusena omandavad rakud autonoomse eksisteerimise võime sarnaselt kunstlikul toitekeskkonnal kasvatatud mikroorganismidele. Muutuste kogumit, mis viivad selliste tunnuste ilmnemiseni rakkudes, nimetatakse transformatsiooniks ja siirdatud koekultuuride rakke nimetatakse transformatsiooniks.

Rakukultuuri tehnikate täiustamine on oluliselt avardanud võimalusi saada siirdatavaid rakuliine paljudest loomade ja inimeste kudedest. Samas ei leitud ka vanusepiirangut, mille ületamisel kaotaksid koed võime kohaneda piiramatu kasvuga in vitro, s.t. ümberkujundamiseks.

Teine siirdatud rakuliinide allikas on pahaloomulised kasvajad. Sel juhul toimub raku transformatsioon in vivo patoloogilise protsessi arengu tulemusena, mille etioloogia jääb suuresti ebaselgeks.

Mitte kõik pahaloomulised kasvajad ei ole võimelised tekitama siirdatavaid rakukultuure. Nii näiteks tehti ebaõnnestunud katseid saada siirdatavaid rakke inimese mao- ja piimanäärmevähi kasvajatest. Naha ja limaskestade lamerakk-kartsinoomi in vitro rakkudega on raske kohaneda. Teisest küljest on liinid suhteliselt kergesti tuletatud närvisüsteemi sarkoomide ja pahaloomuliste kasvajate kudedest.

2. Toiteainekeskkond

Igas rakukultuuris on raku- ja vedelfaas. Vedelfaas tagab kultiveerimisrakkude elutegevuse ning on erineva koostise ja omadustega toitainekeskkond.

Kõik meediad jagunevad vastavalt oma eesmärgile kasvuks ja toetuseks. Kasvukeskkond peaks sisaldama rohkem toitaineid, et tagada rakkude aktiivne paljunemine, et moodustuks klaaspinnale monokiht või piisavalt kõrge rakuelementide kontsentratsioon suspensioonis (suspensioonkultuuride saamisel). Tegelikult peaks tugisööde tagama rakkude ellujäämise ainult juba moodustunud monokihis viiruslike ainete paljunemise ajal rakkudes.

Kasvu- ja tugimeedia on mitmekomponendiline. Need võivad hõlmata nii looduslikke tooteid (amniootilised vedelikud, loomaseerumid) kui ka looduslike saaduste osalise töötlemise tulemusena saadud substraate (embrüoekstraktid, laktalbumiini hüdrolüsaat, hemohüdrolüsaat, aminopeptiid jne), aga ka sünteetilisi keemiliselt puhtaid aineid (amino). happed, vitamiinid, soolad).

Täielikult looduslikest koostisosadest koosneva toitesöötme näide on Buckley sööde, mis on ette nähtud rakukultuuride kasvatamiseks ahvide neeruepiteelist. See sööde sisaldab veise lootevett (85%), hobuse seerumit (10%) ja veise loote ekstrakti (5%).

Kõik looduslikud tooted on madala tasemega, nende kasutamine on seotud suure ohuga rakukultuuride mikroobse ja viirusliku saastumise tekkeks. Sellega seoses asendatakse need järk-järgult sünteetiliste standardsegudega. Sünteetiline meedium 199 ja nõelkandja leiavad suurima rakenduse. Laialdaselt kasutatakse söödet, mis sisaldab rangelt määratletud koguses sooli, aminohappeid ja vitamiine.

Olenemata kasutusotstarbest on kõik koekultuurisöötmed loodud mingi tasakaalustatud soolalahusega, millel on piisav puhverdusvõime. Enamasti on need Hanksi ja Earli lahendused. Need lahused on iga toitainekeskkonna oluline komponent. Enamiku kasvusöötmete lahutamatuks komponendiks on loomaseerum (vasikas, veis, hobune), ilma 5--10% olemasoluta ei toimu rakkude paljunemist ja monokihi moodustumist.

Seerumi lisamine samal ajal takistab täpse keemilise koostisega kasvusöötmete loomist, mis on rakufüsioloogia fundamentaaluuringute arendamiseks väga olulised, kuna koos seerumi (või selle derivaatidega) viiakse sisse terve kompleks kontrollimatuid tegureid. , mis varieeruvad olenevalt seerumi seeriast.

1950. aastatel pakkusid Ewans ja Waymouth välja täpse keemilise koostisega seerumivaba söötme. Kuid need söötmed ei andnud neid raku proliferatiivse aktiivsuse näitajaid, mis määravad söötme seerumite lisamisega. Sellega seoses pakuvad huvi Kase ja Pirdi tööd, kes näitasid, et Fe, Zn, Cu ja ka MnC1 2 sulfaatsoolade kaasamine on määrav rakkude intensiivse kasvu tagamiseks seerumivabas söötmes.

Antibiootikume lisatakse kasvusöötmele, samuti kudede pesemiseks mõeldud puhverlahusele. Need lisatakse söötmesse vahetult enne kasutamist kiirusega 1 ml antibiootikumide põhilahust 500 ml söötme kohta.

Allpool on toodud ühe levinud söötme koostis ja valmistamismeetod.

Kolmapäevane nõel

l-arginiin - 17,4

l-tsüstiin - 4,8

l-histidiin - 3,1

l-isoleutsiin - 26,2

l-leucia - 13,1

l-lüsiin - 14,6

l-metioniin - 7,5

l-fenüülalaniin - 8,3

l-treoniin - 11,9

l-trüptofaan - 2,0

l-türosiin - 18,1

l-valiin - 11,7

biotiin - 0,24

koliin - 0,12

koliinkloriid - 0,14

vitamiin B 12 (pteroüülglutamiinhape) - 0,44

nikotiinamiid - 0,12

pantoteenhape - 0,22

kaltsiumpantotenaat - 0,48

püridoksaal (püridoksiinvesinikkloriid) - 0,20

tiamiinvesinikkloriid - 0,34

riboflaviin - 0,04

naatriumkloriid - 5850,0

kaaliumkloriid - 373,0

monoasendatud naatriumfosfaat (NaH 2 PO 4. H 2 O) - 138,0

kaltsiumkloriid - 111,0

naatriumvesinikkarbonaat (NaHCO 3) - 1680,0

magneesiumkloriid (MgCl 2. 6H 2 O) - 102,0

glükoos - 900,0

l-glutamiin - 146,2--292,3

penitsilliin - 50,0

streptomütsiin - 50,0

fenoolpunane - 5,0

vesi kuni 1000,0

Kokkamine.

Lahus 1. 500 ml ligikaudu 80 °C-ni kuumutatud vees lahustatakse ülaltoodud kogused aminohappeid segades, seejärel lisatakse l-glutamiin ja fenoolpunane.

Lahus 2. Lahustage 100,0 ml vees anorgaanilised soolad, välja arvatud naatriumvesinikkarbonaat (NaHCO 3 ), segage eelmise anorgaaniliste soolade lahusega ning lisage biotiin ja vitamiin B 12 .

Lahus 3. Kõik vitamiinid lahustatakse 200,0 ml vees, välja arvatud biotiin ja ptero-üülglutamiinhape ning antibiootikumid - penitsilliin ja streptomütsiin. Kõik lahused steriliseeritakse filtrimisega läbi klaasist imifiltri (poorne klaasplaat, pooride suurus 0,7--1,5) või läbi Seitzi asbesttselluloosiplaatide pärast eelpesu veega ja seejärel valmistatud lahusega.

Segage 500 ml lahust 1 + 200 ml lahust 2 + 200 ml lahust 3 ja lahjendage steriilse veega 1000,0 ml-ni. Võite lisada 1 mg inositooli 1 liitri kohta.

3. Rakukultuuride saamine

3.1 Primaarsete rakukultuuride valmistamine

Primaarne - nimetatakse kultuuriks, mis on saadud koest ja mida kasvatatakse in vitro enne subkultuuri algust, st enne esimest saaki. Primaarses kultuuris puuduvad paljud algkoes olevad rakud, kuna kõik rakud ei ole võimelised substraadile kleepuma ja in vitro ellu jääma. Rakkude kultiveerimise käigus on kultuuris suhteliselt vähe mittejagunevaid või aeglaselt jagunevaid rakke.

Primaarkultuuri saamise esimeses etapis eemaldatakse koefragment, loomaorgan ja selle mehaaniline või ensümaatiline lagunemine steriilselt. Kude purustatakse tükkideks mahuga kuni 1-3 mm, koetükid pestakse erütrotsüütidest Hanki lahusega koos antibiootikumidega. Kudede lagunemiseks kasutatakse trüpsiini (0,25% toor- või 0,01-0,05% puhastatud) või kollagenaasi (200-2000 ühikut/ml, toores) ja teisi proteolüütilisi ensüüme. See kultuuri saamise meetod tagab suure rakkude saagise.

Primaarseid kultuure võib saada ka 1 mm suurustest koetükkidest, mis kleepuvad substraadi pinnale oma nakkuvuse või tassil olevate sälkude tõttu või plasmaklombi abil. Sellistel juhtudel kasvavad rakud fragmentidest. Eksplantaatidest migreeruvaid rakke saab kasutada passaažiks. Kudede fragmendid (eksplantaadid) kantakse üle uutele tassidele, rändavad rakud saab eemaldada subkultuuri, verseeni ja trüpsiini seguga ning allesjäänud eksplantaatidest moodustuvad uued väljakasvud.

Sellised primaarsed kultuurid nagu tibu embrüo fibroblastide kultuur, vasika neerurakkude kultuur ja leukotsüüdid on tuntud.

3.2 Ühekihiliste pidevate rakukultuuride saamine

Nagu eespool märgitud, on üks siirdatavate rakuliinide saamise meetodeid primaarsete kultuuride populatsioonist suurenenud kasvu- ja paljunemisaktiivsusega rakkude selekteerimine. Selekteerimist saab läbi viia korrapäraselt keskkonda muutes, pestes esmase trüpsiinitud rakukultuuri monokihti. Selleks valitakse hästi vormitud raku monokihiga madratsid (madratsid ise peavad olema lameda põhjaga ning seintel ei tohi olla kriimustusi ja tuhmi kohti). Süstemaatiliseks muutmiseks ettevalmistatud kasvusööde valatakse väikestesse anumatesse (bakteriaalse saastumise välistamiseks) ja säilitatakse temperatuuril t - 4 °.

Söödet vahetatakse regulaarselt, vähemalt kord nädalas. Esimese 3 nädala jooksul asendatakse 20-30% kasvusubstraadi mahust, järgmise 3-4 nädala jooksul - 50-60%, hiljem viiakse läbi täielik söötme vahetus. Värske keskkond vahetult enne tööd kuumutatakse temperatuurini t - 37 °.

Sööde muutudes muudavad rakud oma morfoloogiat. Mõned rakud on ümarad ja kukuvad klaasilt maha. Enamik rakke kahaneb keskpunkti suunas ja monokiht omandab tähekujulise välimuse. Rakud ise on veidi piklikud. Pärast 7-10 keskkonnamuutust madratsites hakkavad reeglina ilmnema uued rakulised elemendid ja erinevates kultuurides on neil erinev morfoloogia.

Tibuembrüo neerurakkude kultuuris ilmuvad monokihi keskele või selle kokkutõmbunud alade vahele ümarad rakulised elemendid, millest järk-järgult moodustuvad väikeste kolooniate kujul kobarad. Ahvide neerurakkude kultuuris tekivad üksikud terad meenutavad moodustised. Rakud on tihedalt üksteise kõrval, moodustades väikesed läbipaistvad kolooniad. Selliste rakkude arv suureneb aeglaselt, ka kolooniate suurus peaaegu ei suurene. Kolooniad ei teki mitte ainult madratsi põhja, vaid ka külgpindadele, toitainekeskkonna piirile. Seetõttu on toitekeskkonna muutmise eelduseks selle konstantse mahu säilitamine. Inimese embrüonaalsete neerurakkude kultuuris ahelateks ahenenud monokihi massilise degeneratsiooni taustal ilmnevad suured hulknurksed pikkade protsessidega rakud.

Valikuprotsessi käigus tekkinud ebatüüpilised rakuelemendid tuleks ülejäänud monokihist eraldada ja viia eraldi katseklaasidesse või madratsitesse. Selleks võib kasutada verseniseerimismeetodit või ebatüüpiliste rakkude mehaanilist lõhustamist bakterioloogilise silmuse või spaatliga. Viimane meetod on eriti vajalik töötamisel ahvide neerude rakukultuuriga, kus ebatüüpiliste rakkude kolooniad on tihedalt klaasi külge kinnitatud ega eraldu sellest ise.

Toitekeskkonna vahetamisel ebatüüpiliste rakkude ilmnemisel on soovitatav suurem osa kasvusubstraadist ettevaatlikult eemaldada ning väiksema osaga monokihti tugevalt loputada ja see sööde katseklaasidesse valada. Sel juhul võivad söötmes ilmuda ebatüüpilised rakud, millel on võime moodustada edasisteks subkultuurideks sobivaid kolooniaid.

Pärast ebatüüpiliste rakkude kultuuri ülekandmist uuele tassile on soovitatav jätkata põhikultuuri jälgimist, kuna uue rakuliini aretamise protsess on väga keeruline ja mitte alati valitud ebatüüpiliste elementide puhul ei teki elujõulist siirdatud rakkude rida. . On vaja, et kogu töö uute rakuliinide saamiseks, mis kestab mitu kuud, toimuks samade toitekeskkonna, loomaseerumite ja antibiootikumide seeriaga.

Tuntud on primaarsed kultuurid, nagu kuldhamstri neerurakkude kultuur (BHK), siberi mägi metskits neerurakkude kultuur (PSGC), rohelise ahvi neerurakkude kultuur (CV).

3.3 Roller-rakukultuur

Kuni viimase ajani kasutati viroloogias koekultuure peamiselt ühekihiliste statsionaarsete kultuuride kujul. Paljudel juhtudel on see rakukultuuri meetod asendamatu. Paljude aastate kogemused näitavad, et ühekihiliste statsionaarsete kultuuride kasutamisel tekib mitmeid raskusi, mis on seotud tohutute tööaja ja materjalide kuludega. Sellest vaatenurgast on tulusamad rullkultuurid, mis on ökonoomsed, mida iseloomustab optimaalne kasvatamispinna ja toitainesöötme mahu suhe ning mis avavad soodsad võimalused rakumassi kogunemiseks.

Termin "rullkultuur" viitab kultiveerimismeetodile, mille puhul raku monokiht paikneb horisontaalselt pöörlevate anumate kogu silindrilisel pinnal ja seda pestakse perioodiliselt toitainekeskkonnaga. Teatud põhjustel võib teatud arvu rakke mõnel juhul söötmes kaaluda. Selles teostuses nimetatakse rakukultuuri rull-suspensiooniks. Rakukultuuri "saagis" on seda suurem, mida suurem on ala, kust rakud kogutakse. Teadlased on kasutanud erinevaid viise, et suurendada pindala, millele rakud saavad kinnituda ja paljuneda. Selleks kasutati mitmesuguseid suure eripinnaga aluseid: kõvasid, käsnjas, villast, kollageenist, klaasspiraalidel jne. Neid meetodeid ei kasutatud laialdaselt, kuna need muutsid rakkudega manipuleerimise palju raskemaks, kuid see peaks olema LS Ratner ja V. A. Krikun kirjeldasid mitmetasandilise kasvatamise meetodit. Rakke kultiveeriti 1,5-, 10- ja 15-liitristes pudelites, mis olid täielikult laetud ovaalsete klaastorudega paralleelselt anumate pikiteljega. Sel juhul suurenes kasulik pindala võrreldes statsionaarsete ühekihiliste kultuuridega sama mahuga anumates 20 korda. Kasvatamine toimus 2 etapis. Esimeses etapis pöörati pudeleid ümber horisontaaltelje, et rakud jaotada ühtlaselt. Seejärel, kui rakud olid klaasi külge kinnitatud, jätkati kultiveerimist statsionaarses asendis. Kirjeldatud kultuurisüsteemi on edukalt kasutatud suu- ja sõrataudi kultiveerimiseks.

Tõhusamaks osutus anumate pöörlemine, milles rakud paljunesid. Esialgu kasvatati rakke katseklaasides, kuid tehniliste seadmete arenedes kasvas kultiveerimisanumate maht ning teadlased läksid pöörlevates katseklaasides rakkude kasvatamiselt üle pöörlevates pudelites. Rullkultuure hakati kasutama nii rakkude akumuleerimiseks kui ka viiruste paljundamiseks.

Rullharimiseks kasutatakse spetsiaalseid rack-and-tier seadmeid pöörlevate pudelite või trumlite jaoks. Kõige sagedamini kasutatakse kasvatamiseks 0,5--3-liitriseid pudeleid. Tootmistingimustes võib nende maht ulatuda 20 liitrini või rohkem. Rullkultuuri seadmed on lihtsad, töökindlad ja kergesti hooldatavad. Suur tähtsus on pudelite pöörlemiskiirusel. See ei tohiks olla liiga kõrge, et mitte takistada rakkude kinnitumist, aga ka mitte liiga madal, kuna rakkude pikaajaline kokkupuude gaasifaasiga halvendab nende toitumistingimusi. Erinevate autorite töödes varieerus pudelite pöörlemiskiirus vahemikus 8–12 pööret minutis kuni 1 pööret minutis. Erinevate rakukultuuride jaoks oli sobivaim viaalide pöörlemiskiirus vahemikus 0,5--1 pööret minutis. Soovitatav esimese 30 minuti jooksul. pärast rakkude külvamist tagage viaalide suur pöörlemiskiirus (0,5–1,0 pööret minutis) materjalide ühtlaseks jaotumiseks, seejärel viige need madalale pöörlemiskiirusele (20–30 pööret minutis).

Seemnete kontsentratsioon 1 ml söötmes on SPEV, VNK-21, HeLa, L rakkude puhul 60-80 tuhat, diploidsete rakkude puhul 100-200 tuhat ja primaarsete kultuuride puhul 200-300 tuhat Kasvukeskkonna maht peaks olema olema 1/10, 1/20 rullipudeli mahust. Rullkasvatusmeetod võimaldab teil saada suurema hulga rakke. Seega on 3-liitrisest viaalist võimalik saada HeLa rakkude saak 8 korda, VNK-21 - 9 korda, AO - 11 korda suurem kui ühekihilise statsionaarse viaaliga viaali kultuuriga. mahutavus 1 l. Meediumisäästu kordus 3-liitriste viaalide kasutamisel on HeLa rakkude puhul 2,8; VNK-21 - 5,0, AO - 4,0. Rullitingimustes kasvamise ja paljunemise võime on subkultuuridel, siirdatud kultuuridel ja harvem primaarsetel, samuti diploidsetel rakutüvedel. Rakkude paremaks paljundamiseks rullseadmetes on vaja neid kohandada uute kultiveerimistingimustega. Rullkultuuri meetod võimaldab saada suurel hulgal rakke. Rullkultuuride eelis võrreldes traditsiooniliste statsionaarsete kultuuridega on eelkõige säästlikum toitekeskkonna kasutamine ja suurem viiruse antigeeni saagis (1-2 lg võrra).

3.4 Suspensioonrakukultuur

1953. aastal demonstreerisid Owens ja kaastöötajad esmakordselt rakkude võimet paljuneda vedelas keskkonnas vabalt hõljuvas olekus. Sellest ajast peale on suspensioonkultuuri meetod pälvinud teadlaste tähelepanu tänu oma suurele efektiivsusele suurte rakkude kogumisel. Selgus, et erinevalt teist tüüpi rakukultuuridest saab siirdatud liinide rakke suspendeeritud olekus kasvatada pikka aega. Nendes tingimustes paljunevad rakud söötme pideva segamise tõttu ilma kultiveerimisnõu seintele kinnitumata, olles suspensioonis. Optimaalse kasvurežiimi korral paljunevad rakud suspensioonides kiiresti ja neil on suurem "saagis" kui statsionaarsetes kultuurides. Primaarsetel ja pidevatel rakuliinidel on erinev võime suspensioonis kasvada. Seega kohanevad heteroploidsed ja aneuploidsed püsiliinid erinevalt pseudodiploidsetest liinidest kiiremini kasvuga suspensioonis.

Suspensioonkultuurid valmistatakse ühekihilistest kultuuridest. Rakud kooritakse klaasilt verseeni ja trüpsiini lahustega. Rakupellet pärast tsentrifuugimist (1000 pööret minutis) resuspendeeritakse värskes toitainekeskkonnas. Valmistatud suspensioon asetatakse kultiveerimisanumatesse (reaktoritesse, fermentaatoritesse) ja kasvatatakse pidevalt segades. Teaduslikes uuringutes on rakkude kontsentratsioon esialgses suspensioonis vahemikus 0,3 kuni 10x10 1 ml kohta. Rakkude optimaalne kontsentratsioon algses suspensioonis peaks olema 2-5x10 1 ml kohta. Earle'i ja tema kaastöötajate sõnul peaks rakkude kontsentratsioon suspendeeritud kultuuris olema selline, et logaritmiline kasvufaas toimuks hiljemalt 16-24 tundi pärast kultuuri valmistamist. Suspensioonrakukultuurid läbivad iseloomulikud etapid: viivitusfaas, logaritmiline kasvufaas, statsionaarne faas ja logaritmiline surmafaas. Esimeses etapis reeglina rakkude arv väheneb, teises etapis rakupopulatsioon suureneb (logaritmiline kasvustaadium), kolmandas etapis rakkude arvu suurenemist ei täheldata (statsionaarne faas). Kui kultiveerimist jätkatakse, leitakse rakkude arvu vähenemise periood - logaritmilise surma faas (hävitamise faas). Rakkude paljunemise kiirust logaritmilises kasvufaasis väljendatakse genereerimisajaga. Generatsiooniaeg viitab perioodile, mis on vajalik kultuuris olevate rakkude populatsiooni kahekordistamiseks. Rakususpensiooni kultiveerimisel on oluliseks tingimuseks vedeliku segamine, mis peab olema pidev ja piisavalt intensiivne, et hoida rakke suspensioonis, takistada nende settimist ja kinnitumist anuma seintele ning samal ajal mitte põhjustada mehaanilist kahju.

Suspensioonikultuuride segamine toimub labadega magnetseguritega, aga ka ringikujuliste kiiktoolidega. Praegu kasutatakse laialdaselt viaalide ja pudelite pöörlemist ümber pikitelje (15-40 pööret minutis). Magnetseguritel on pöörlemiskiirus 100--200 p/min. Segamiskiirus sõltub kultuuri mahust; väikesed kultuurimahud nõuavad väikest kiirust, samas kui suurte koguste puhul tuleb seda suurendada. Silikoniseerimine viiakse läbi selleks, et vältida rakkude settimist anuma sisepinnale. Silikoonkate takistab oma hüdrofoobsuse tõttu rakkude kinnitumist veresoone seina külge.

Kultiveerimisnõu siseseinad niisutatakse 5% või 10% silikoonilahusega ning pärast lahusti (benseen, atsetoon) aurustamist hoitakse anumaid temperatuuril 85°C ja 200° (vastavalt 30 ja 60 minutit). ). Pärast jahutamist täidetakse anumad kuuma bidestilleeritud veega ja jäetakse 2 tunniks seisma, seejärel loputatakse neid 3 korda bidestilleeritud veega ja kuivatatakse 100°C juures. Anumaid steriliseeritakse ahjus 170°C juures 2 tundi.

Maksimaalset rakukasvu suspensioonis täheldatakse pH 7,0-7,2 juures. Rakkude kasvatamiseks suspensioonis kasutatav toitekeskkond ei erine söötmest, mida kasutatakse rakuliinide kasvatamiseks ühekihilises kultuuris. Kõige sagedamini võetakse rakkude kasvatamisel suspensioonides Eagle'i söödet kahekordse aminohapete ja vitamiinide kontsentratsiooniga.

Suspensioonkultuurid tarbivad 2-7 korda rohkem glükoosi kui ühekihilised. Glükoosi tarbimise käigus eraldavad rakud keskkonda neile mürgist piimhapet. Rakkude glükoosi tarbimine ja piimhappe tootmine kulgevad paralleelselt ja sõltuvad otseselt rakupopulatsiooni tihedusest. Kasulikuks osutus toitekeskkonnale insuliini lisamine koguses 40–200 RÜ 1 liitri kohta. Insuliini lisamine toitainekeskkonnale muudab imendunud glükoosi koguse ja vabaneva piimhappe koguse suhet. L-rakkude puhul saab seda koefitsienti vähendada 74-81-lt 37-38% -ni.

Toitekeskkonnast tarbitakse erinevaid aminohappeid erineva kiirusega rakkude kasvatamisel. Märgitakse, et regulaarne arginiini (20-40 mg/l) lisamine ja glutamiini koguse suurendamine 450 mg/l-ni soodustavad suspendeeritud kultuuride kasvu.

Inositooli (0,4 mg/l) lisamine kiirendab inimese lootevee rakukultuuride kasvu. Söötmele on soovitav lisada katalaasi (1 mg/l) ja türoksiini (12 mg/l).

Suurt huvi pakuvad tööd, mis on pühendatud suspendeeritud rakukultuuride saamisele sünteetilises söötmes, mis ei sisalda vereseerumit. Toitekeskkonna viskoossust üritatakse tõsta valguvabade koostisosade arvelt. Sel eesmärgil kasutatakse metüültselluloosi ja hüaluroonhapet.

Metüültselluloosil kontsentratsioonis 0,1-0,2% on maksimaalne kaitsev toime söötmes suspendeeritud rakkudele. Metüültselluloosi kaitsev toime seisneb selles, et molekulid moodustavad raku ümber kaitsekihi, vältides raku kahjustamist söötme segamisel. Suspensioonikultuuri oleku väga oluline näitaja on hapniku osarõhk vedelas faasis. Hapniku kontsentratsioon gaasifaasis sõltub rakupopulatsiooni tihedusest ja jääb sageli alla atmosfääri. Hapnikupuudus põhjustab tsütoplasma granulatsiooni, rakud kaotavad oma korrapärase ümara kuju. Kerge hapniku ülejäägi korral on rakkudel selgelt määratletud, korrapärane, ümar kuju ja need muutuvad liigse hapniku kahjuliku mõju tõttu väga suureks. Erinevate rakukultuuride optimaalne hapnikukontsentratsioon jääb vahemikku 9–17% ehk 293 mm Hg. sammas. Üle 20% hapnikusisalduse korral on rakkude kasv pärsitud. Seega 24% hapnikukontsentratsiooni juures vähenes küüliku embrüonaalsete neerurakkude (ERK line) paljunemine poole võrra ja 30% juures nullini. Hapniku kontsentratsiooni tõus avaldab raku ainevahetusele toksilist mõju.

Seega sõltub rakkude paljunemine suspensioonis rakkude kontsentratsioonist esialgses suspensioonis, söötme aeratsioonist ja pH-st, toitekeskkonna koostisest, segamismeetodist, suspensiooni mahust ja muudest teguritest.

Suspensiooni homogeensus, rakkude pikaajalise säilitamise võimalus kasvu logaritmilises faasis, rakkude kasvuprotsesside matemaatilise modelleerimise väljavaated sõltuvalt keskkonnategurite mõjust, rakkude füsioloogilise seisundi mitmete uuringute mugavus. rakukultuur suspensioonis, meetodi kõrge efektiivsus - see ei ole täielik loetelu suspensioonkultuuride eelistest.

Suspensioonkultuure kasutatakse laialdaselt viroloogilistes uuringutes ja suurte koguste viirust sisaldava materjali akumuleerimiseks, vaktsiinide ja diagnostiliste preparaatide valmistamisel.

3.5 Rakkude kasvatamine mikrokandjatel

1967. aastal pakkus Van Werel välja kultiveerimismeetodi, mis ühendab monokihi ja suspensiooni rakkude kasvu elemente, mida ta nimetas "mikrokandja" meetodiks. Selle olemus seisneb selles, et rakud kinnituvad ja paljunevad polümeersete kuulide - "mikrokandjate" (MN) osakeste pinnal, mis sisalduvad suspensioonis, kasutades segamisseadet, näiteks segajat. Ühele 160–230 mm läbimõõduga MN osakesele mahub 350–630 (ehk keskmiselt 460) rakku. Ühes ml söötmes võib suspendeerida mitu tuhat mikrokandjaosakest, mille kogupindala on mõnest kuni 50 cm2/ml.

Kultivaatorisse inokuleeritud rakud kinnituvad MN-osakeste pinnale ja paljunevad, moodustades igal üksikul osakesel pideva monokihi.

Selle meetodi peamised eelised on:

1) kogu anuma mahus ühtsete tingimuste loomine, mis võimaldab tõhusalt kontrollida vajalikke parameetreid (pH, p0 2 jne); 2) rakupopulatsiooni kõrge tiheduse saavutamine kuni 5-6 miljonit rakku 1 ml kohta; 3) mitmesaja miljardi rakkude üheaegne kultiveerimine; 4) pideva kontrolli juurutamine rakkude kasvu dünaamika üle; 5) saastumise kasvu vähenemine kultiveerimisanuma rõhu vähendamisega seotud toimingute vähenemise tõttu; 6) oluline kokkuhoid toitekeskkonnas; 7) võime hoida kasvanud rakke madalatel temperatuuridel otse osakestel; 8) oskus luua kunstlikult erinevaid kontsentratsioone MN-e neile kasvatatud rakkudega; 9) kultuuri läbimise võimalus ilma trüpsiini kasutamata, lisades mikrokandja värskeid portsjoneid.

Mikrokandjatel peab olema:

Väike positiivne laeng vahemikus 1,5-1,8 MEKV / g. Kuna enamikul loomarakkudel on nõrgalt negatiivne laeng, kinnituvad nad sellisele MN-ile kergemini:

Tihedus 1,05--1,15 g/cm; näidatud tihedus on optimaalne MN hoidmiseks suspensioonis;

Osakeste läbimõõt on 100 kuni 250 mikronit, mis annab alad mitmesaja raku kasvuks;

Sile pind;

Läbipaistvus;

Komponentide toksilisuse puudumine rakkudele;

Keskmiste komponentide kerge imendumine;

Mitmekülgsus, mis annab võimaluse kasutada neid primaarsete, diploidsete ja heteroploidsete rakkude jaoks. Vähese tähtsusega pole MH omadused, mis võimaldavad neid korduvalt kasutada.

aastal viidi läbi paljude erineva keemilise iseloomuga graanulite, sealhulgas ristseotud (PS) dekstraanist, PS-agaroosist, PS-polüvinüülpürrolidoonist, polüakrüülnitritist, poorsest silikageelist, polüstüreenist, kapronist, nailonist ja alumiiniumsilikaadist valmistatud preparaatide uuring. kasutada neid mikrokandjatena.

Sobivad on neist vaid mõned, peamiselt PS-dekstraani baasil.

Mitmed välisfirmad on välja töötanud mikrokandjate kasutusvalmis kaubanduslikud preparaadid: Cytodex-1, 2, 3 (Prantsusmaa, Rootsi), Superbit (USA, Inglismaa), Biosilon (Taani). Nende ravimite maksumus on üsna kõrge, seetõttu on vaja läbi viia uuringud kodumaiste MN-ide väljatöötamise ja tootmise kohta.

Rakukultuur mikrokandjatel viiakse läbi tavalistes suspensioonkultuuri fermentaatorites. Fermentaatoril ei tohiks olla eendeid, taskuid, et vältida mikrokandjate kogunemist seisvatesse tsoonidesse. Seetõttu on mõistlik kasutada ümara põhja ja siledate seintega fermentereid. Fermentaatori sisemus peab olema silikoonitud, et vältida mikrokandjate kleepumist fermenteri klaasi või roostevaba terase külge.

Standardvarustust saab kasutada põllukultuuride tingimuste (nt pH ja O 2 ) kontrollimiseks. Suspensiooni ja kandjaga segamise kiirus peaks olema 40-60 pööret minutis. MH-l kasvatamiseks kasutatakse erinevat tüüpi rakke.

Cytodexi kontsentratsioon võib varieeruda vahemikus 0,5 kuni 5 mg/ml. Kuid profülaktiliste vaktsiinide valmistamisel kasutatakse tavaliselt tsütodexi lõppkontsentratsiooni, mis ei ületa 1 mg/ml. Kontsentratsiooni suurendamine 3 mg/ml ja üle selle tekitab täiendavaid raskusi, mis on seotud toitainekeskkonna perfusiooni ja selle osalise asendamise vajadusega, mis raskendab tehnoloogilist protsessi.

Rakkude inokulaadi kontsentratsioon, samuti esimestel tundidel MN-l kultiveerimise tingimused määravad suuresti rakkude proliferatsiooni ja maksimaalse akumulatsiooni optimaalsed parameetrid. Näidati, et ahvi neerude (Vero) ja diploidsete inimese embrüonaalsete fibroblastide rakkude (MRC-5) pideva rea ​​inokuleerimine keskmises mahus 10 rakku/ml vähendati 1/3-ni ja perioodiliselt (30 pööret minutis) sisse lülitatud segajaga. ) üks minut iga tunni järel 4 tunni jooksul, millele järgneb toitekeskkonna lisamine lõppmahuni, põhjustab rakkude proliferatsiooni ja nende arvu suurenemist võrreldes kontrolliga (toitekeskkonna täismaht raku ajal istutamine ja segaja pidev töötamine kasvatamise algusest peale).

Toitekeskkond on oluline rakkude kultiveerimiseks MN-l. Toitekeskkonna õige valik aitab optimeerida ka rakkude proliferatsiooni protsessi ja nende kvaliteeti. Rakkude kultiveerimiseks erinevat tüüpi MN-idel on vaja valida toitainekeskkond. Näidati, et ahvi neerude siirdatud rakuliin (Vero) tsütodexil annab suurima saagise Eagle DME söötme kasutamisel (istutusrakkude kontsentratsioon 10 5 ml), kuid võrreldes BME ja 199 söötmega.Kui rakkude arvu istutamise ajal vähendatakse 10 4-ni, siis annab tulemused parim sööde 199. Kõik testitud söötmed sisaldasid 10% looteseerumit.

3.6 Viiruste kasvatamine rakukultuurides

Praegu kasutatakse loomaviiruste isoleerimiseks ja paljundamiseks primaarseid kultuure, rakutüvesid ja väljakujunenud rakuliine. Üldiselt on protseduur kõigi viiruste puhul sama.

Sööde eemaldatakse raku monokihist ja monokihti pestakse tasakaalustatud puhverdatud soolalahusega (SBSR) või fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS), et eemaldada söötmes esineda võivad inhibiitorid (antikehad). Viiruse osakesed suspendeeritakse väikeses koguses SBSR-is või PBS-is ja adsorbeeritakse rakkude poolt 30–60 minuti jooksul. Seejärel asendatakse soolalahused värske söötmega.

Kultiveeritud rakkude nakatumine viirustega põhjustab rakkudes iseloomulikke morfoloogilisi muutusi. Lõplikud degeneratiivsed rakuprotsessid (tsütopatogeenne toime, CPE) tuvastatakse alles pärast mitmenädalast kasvu viiruste juuresolekul, kuid mõnel juhul tuvastatakse CPE juba 12 tunni pärast.Morfoloogiliste muutuste detailid on erinevate viiruste puhul erinevad.

Kui viirus põhjustab produktiivse infektsiooni asemel rakulist transformatsiooni, siis kaasnevad sellega ka iseloomulikud muutused rakkude kasvu morfoloogias ja omadustes.

4. Ettevaatusabinõud viirusega nakatunud rakkude käsitsemisel

Viirustel on tsütopatogeenne toime ja need toimivad paljude inimeste ja loomade haiguste etioloogiliste teguritena. Lisaks näivad paljud viirused (nt onkornaviirused, II tüüpi herpesviirus, adenoviirused, polüoomiviirus ja SV40) olevat loomadel kasvajat põhjustavad ained. Kuna viirused suudavad läbida bakterifiltreid, võib viiruste eemaldamine nakatamata rakukultuuridest olla keeruline viirussuspensioonide juuresolekul, kus on võimalik viiruse ülekandumine kultiveerimisruumi õhu kaudu.

Järgmised ettevaatusabinõud on üldise iseloomuga ja kehtivad ainult siis, kui viirused ei kujuta endast erilist ohtu. Väga ohtlike viiruste kasutamisel, mis kujutavad endast ohtu laboritöötajatele või ümbritseva maailma inimestele ja loomadele, tuleb võtta kasutusele täiendavad ettevaatusabinõud. Eriti murettekitavad viirused on Newcastle'i haiguse viirused, suu- ja sõrataudi viirused, vesikulaarse stomatiidi viirused, rõugeviirused, marutaudiviirused, B-tüüpi herpesviirused jne. Lisaks ei saa olla kindel, et isegi sellised viirused nagu SV40 inimestele ohtu ei kujuta.

Rakkude nakatamiseks ja viirusega nakatunud rakkude kasvatamiseks tuleb kasutada spetsiaalset ruumi või ruumide rühma.

Nendest ruumidest ei tohi eemaldada elusaid viiruseid, välja arvatud juhul, kui need on tihedalt suletud mahutites. Tuleb võtta ettevaatusabinõud tagamaks, et nende mahutite välispinnad ei oleks viirusosakestega saastunud.

Viirustega töötamisel tuleb kasutada spetsiaalset kaitseriietust (laborikitlit). Pärast tööd tuleks need riided asetada autoklaavimiseks spetsiaalsesse paaki.

Kõiki viirustega kokku puutunud kandjaid ja klaasnõusid tuleb töödelda klooriga; alles pärast seda saab neid viirustega töötamiseks mõeldud ruumist välja viia.

Kõik plastikust nõud tuleb asetada spetsiaalsesse autoklaavimispaaki.

Seadmed viirusmaterjali hoidmiseks ja käitlemiseks peaksid asuma viiruste käitlemise rajatises.

Labor peaks olema varustatud kahetsükliliste autoklaavidega, et laboripersonal oleks kaitstud kahjulike materjalide eest.

4.1 Viiruse tuvastamine

Viirusi saab tuvastada ja kvantifitseerida, kasutades mitmeid erinevaid teste, näiteks:

1) Viiruse aktiivsust mõõdetakse viirust sisaldava materjali koguse määramisega, mis on vajalik peremeesorganismis spetsiifilise vastuse esilekutsumiseks. Viiruse poolt indutseeritud vastus võib olla kas kõik või mitte midagi (st infektsiooni olemasolu või puudumine) või seda saab kvantifitseerida, näiteks infektsiooni ilmnemiseni kuluv aeg või kahjustuste arv vastuvõtlikus rakus. kiht. Viiruse aktiivsuse kvantitatiivset määramist nimetatakse tiitrimiseks.

Väiksemat viiruse kogust, mis võib põhjustada sobivat reaktsiooni, nimetatakse nakkuslikuks ühikuks ja viiruse esialgse suspensiooni tiitrit väljendatakse nakkuslike ühikute arvuna mahuühiku kohta. Näiteks kui nakatunud kopsukoe suspensiooni lahjenduses 1:10 6 intranasaalselt süstimisel hiirel kopsupõletikku põhjustava gripiviiruse suspensiooni minimaalne kogus on 0,1 ml, tähendab see, et gripiviiruse tiiter kopsukoe esialgne suspensioon on 107 nakkuslikku ühikut 1 ml kohta--1/(10~1-10-6)=107.

Reeglina on viiruse tiitrimismeetodi kohustuslik komponent test, mis võimaldab hinnata inokulatsiooni tulemust positiivseks või negatiivseks. Näiteks loomaviiruste tiitrimisel võib selliseks testiks olla nähtavate kahjustuste olemasolu või puudumine rakukultuuris, põletikuline reaktsioon viiruse inokuleerimise kohas nahas või sarvkestas, halvatus, mis tuleneb viiruse sissetoomisest looma aju jne. Mõnikord on viiruse paljunemist võimalik tuvastada isegi siis, kui peremeesorganismi reaktsioon puudub: näiteks saab kanaembrüote nakatumist müksoviirustega tuvastada hemaglutiniinide ilmumise järgi allantoisis vedelik.

Parimad tulemused saadakse tiitrimismeetoditega, mis põhinevad teadaoleva koguse viirust sisaldava materjaliga nakatunud rakukihi kindlas piirkonnas diskreetsete kahjustuste loendamisel. Juhtudel, kui viirusele vastuvõtlike ja ligipääsetavate rakkude arvu võib pidada praktiliselt lõpmatult suureks, näiteks kui ühekihiline bakterikultuur toitaineagaril on nakatunud faagiga või kui pidev ühekihiline loomarakkude kultuur on nakatunud viirus, viiruse põhjustatud kahjustused või faagist moodustunud naastud on selles mõttes sarnased bakterikolooniatega tihedal toitainekeskkonnal. Nii nagu nende kolooniate arv on võrdeline tiitritavas preparaadis sisalduvate bakterirakkude arvuga, on ka naastude arv otseselt proportsionaalne ühekihilisse kultuuri lisatud viiruse kogusega, viirusosakeste moodustumisega nakatunud rakkude poolt, mis saab tuvastada näiteks nukleiinhapete olemuse ja osakeste sümmeetria järgi.

2) Nukleiinhapete tootmine nakatunud rakkude poolt, millel võib olla iseloomulik tihedus või iseloomulik suurus agaroosgeelelektroforeesi või sahharoosi kontsentrteel.

3) Nakatunud rakkude või transformeeritud rakkude poolt iseloomulike antigeenide moodustumine, mida saab visualiseerida fluorestseeruvate spetsiifiliste antikehadega värvimisega või põhjustada rakumembraanis muutusi, mis põhjustavad heemi adsorptsiooni. Otsese meetodi korral kombineeritakse viiruse antigeenide vastu tekitatud antikehad fluorokroomiga ja neid kasutatakse nakatunud rakkude värvimiseks. Positiivne reaktsioon (fluorestsentsmikroskoobis kollakasroheline) näitab viiruse antigeenide olemasolu rakkudes. Seda meetodit saab seetõttu kasutada raku transformatsiooni tuvastamiseks, kui antikehad genereeritakse näiteks SV40 viiruse varajaste antigeenide vastu, või küpsete viiruste moodustumise tuvastamiseks, kui antikehad genereeritakse kapsiidvalkude vastu. Kaudse meetodi puhul ei kombineerita antikehi fluorokroomiga. Selle asemel lisatakse pärast fikseeritud rakupreparaatides antikehade interaktsiooni antigeenidega neile fluorokroomiga konjugeeritud gammaglobuliinivastaseid antikehi. See meetod on tundlikum ja väldib iga üksiku antikeha konjugeerimist fluorestsentsvärviga. Seega saab samu fluorestseeruvaid küüliku antikehade vastaseid antikehi (saadud lammastelt küüliku gammaglobuliinide vastu) kasutada mis tahes küülikutes toodetud antikehade värvimiseks, mis interakteeruvad viiruse antigeenidega produktiivselt nakatunud või transformeeritud rakkudes. Veelgi kaudsem, kuid palju tundlikum meetod, mis ei nõua fluorestsentsmikroskoobi kasutamist, on peroksidaas-antiperoksidaasi meetod. Selle meetodi kohaselt interakteeruvad küüliku antikehad fikseeritud rakuantigeenidega ja seejärel kaetakse kitse antikehadega küüliku immunoglobuliinide vastu, mis on konjugeeritud mädarõika peroksidaasi ja küüliku antiperoksidaasi kompleksidega. Pärast seda töödeldakse preparaate diaminobensidiini ja vesinikperoksiidiga; pruun värv näitab antigeenide olemasolu.

4) Antigeenide olemasolu viirusosakestel võib põhjustada hemaglutinatsioonireaktsioone, mis võimaldab kvantitatiivset hindamist. Paljudel viirustel on antigeenid, mis võivad punalibledele adsorbeeruda ja põhjustada nende kokkukleepumist. Suure hulga viirusosakeste ja erütrotsüütide vastasmõjul tekib rakkude võrgustik ja suspensioon aglutineerub, st. erütrotsüüdid sadestuvad. Teatud spetsiifilisus on selles, et teatud viirused põhjustavad teatud loomade erütrotsüütide aglutinatsiooni, kuid aktiivse kombinatsiooni leidmisel saab hemaglutinatsioonist kiirtest viiruse tiitri määramiseks. Veri võetakse hepariniseeritud süstlasse ja erütrotsüüte pestakse kolm korda 10 minuti jooksul 0,85% NaCl lahuses 200 g juures. Lõplik erütrotsüütide sete suspendeeritakse 200-kordses mahus 0,85% NaCl lahuses. Kõige mugavam viis hemaglutinatsiooni testimiseks on mikrotiiterplaatidel. Lisage seeriasse mikrotiiterplaadi süvenditesse 25 µl 0,85% NaCl või PBS; Esimesse süvendisse lisatakse 25 μl viirussuspensiooni ja segu segatakse (lahjendus 1:2). Seejärel viiakse 25 µl esimesest süvendist teise (lahjendus 1:4) ja nii edasi, kuni lõplik lahjendus on 1:2048. Seejärel lisatakse igasse süvendisse 25 µl erütrotsüütide suspensiooni, segu segatakse ja jäetakse temperatuurile 4 °C, toatemperatuur või 37 °C kuni hemaglutinatsiooni tekkeni (1-2 tundi). Kaevudes, kus on toimunud aglutinatsioon, on erütrotsüütide sete ebakorrapärase kujuga ja kaevudes, kus hemaglutinatsiooni pole toimunud, moodustab rakusette kaevu põhjas kompaktse täpi. Tiitriks loetakse lahjendust viimases süvendis, milles hemaglutinatsioon toimus, ja sellele lahjendusele omistatakse 1 hemaglutinatsiooniühik (HAU). Eelmine lahjendus sisaldab vastavalt 2 HAU-d ja nii edasi.

5) Nakatunud rakkude poolt iseloomulike ensüümide või ensüümide moodustumine, mis on nende omaduste järgi kergesti eristatavad peremeesrakkude vastavatest ensüümidest.

4.2 Pikornaviiruste kultiveerimine 3. tüüpi polioviiruse saamise näitel HeLa rakukultuuris

Spetsiifilise viiruste kultiveerimise tehnikana võib nimetada meetodit polioviiruse kasvatamiseks pidevates rakkudes.

Kõik protseduurid viiakse läbi steriilsetes tingimustes.

Teatud HeLa rakkude alamliinid (nt HeLa S3) võivad kasvada madala kaltsiumiioonisisaldusega söötmes (nt CaS2MEM). Tõhusaks nakatumiseks on oluline, et rakud kasvaksid hästi homogeenses suspensioonis. Rakud sadestatakse madala kiirusega tsentrifuugimisega (15 minutit 900 g juures) ja resuspendeeritakse CaS2MEM-is kontsentratsioonini ~2. 107 rakku/ml (~1/20 esialgsest mahust).

Viirus lisatakse rakususpensioonile kontsentratsioonis 10-50 PFU raku kohta; inkubeerige seda magnetsegistil 1 tund 35 °C juures.

Suspensioon lahjendatakse sama söötmega kontsentratsioonini 2. 106 rakku/ml ja lisage 100 μCi [3H]-uridiini.

Rakususpensiooni inkubeeritakse 8 tundi, misjärel rakud sadestatakse madala kiirusega tsentrifuugimisega (15 minutit 900 g juures) ja pestakse üks kord magneesiumi- ja kaltsiumiioonideta fosfaatpuhverlahusega (PBS).

Rakud resuspendeeritakse PBS-is (5-107 rakku/ml) ja allutatakse kolmele külmutamise-sulatamise tsüklile.

Rakujäänused eemaldatakse tsentrifuugimisega.

Supernatanti hoitakse edasiseks puhastamiseks.

Bibliograafia

1. Adams R. Rakukultuuri meetodid biokeemikutele. - M.: Mir, 1983, 263 lk.

2. Viroloogia. meetodid. / Toim. B. Meikhi. - M.: Mir, 1988, 344 lk.

3. Golubev D.B., Sominina A.A., Medvedeva M.N. Juhised rakukultuuride kasutamiseks viroloogias. - L .: Meditsiin, 1976, 224 lk.

4. Djakonov L.P., Gluhhov V.F., Pozdnjakov A.A., Denisenko G.F., Kalmõkova T.P. Loomade rakkude ja kudede kasvatamine. - Stavropol: Stavrop. Pravda, 1988, 2. osa, 91 lk.

5. Loomarakk kultuuris all. toim. L.P. Dyakonova, V.I. Sitkova. - M.: 2000.

6. Loomarakkude kultiveerimine. meetodid. / Toim. R. Freshni. - M.: Mir, 1989, 333 lk.

7. Veterinaarviroloogia juhend. / Toim. V.N. Shurin. - M.: Kolos, 1965, 687 lk.

8. Sergejev V.A. Loomade viiruste paljundamine ja kasvatamine. - M.: Kolos, 1976, 303 lk.

9. Fenner F., McOslen B., Mims S., Sambrook J., White D. Loomaviiruste bioloogia. - M.: Mir, 1977, 1. kd, 447 lk.

Majutatud saidil Allbest.ru

...

Sarnased dokumendid

Peamised kanaembrüote nakatumise viisid viirusega. Subkultuuride saamise etapid: rakukihi eemaldamine, rakkude eraldamine ja külvamine, rakukultuuride viirusega nakatumise meetod, tulemuste registreerimine. Inimese ja loomarakkude poolpüsikultuurid.

esitlus, lisatud 29.01.2015


Toitekeskkonnad mikrobioloogias, nende klassifikatsioon ja sordid, kasutusalad ja -omadused. Aeroobsete ja anaeroobsete mikroorganismide kasvatamine. Mikroorganismide kvantitatiivse arvestuse meetodid, nende kultuuride säilitamise põhireeglid ja tingimused.

abstraktne, lisatud 25.03.2013


Flavaanid kõrgemates taimedes: struktuur, peamised esindajad, lokaliseerimine, funktsionaalne roll. Teetaimede raku- ja kalluskultuuride morfofüsioloogilised ja biokeemilised omadused. Flavaanide ja proantotsüanidiinide sisalduse määramine.

lõputöö, lisatud 02.02.2018


Kandjate tüübid rakkude ja ensüümide immobiliseerimiseks. Immobiliseeritud kultuurid ja nende kasutamise võimalus erinevates tööstusharudes. Immobiliseeritud kultuure kasutavate reaktorite tüübid. Immobiliseeritud kultuuride kasutamise eelised ja puudused.

kursusetöö, lisatud 15.01.2012


Kunstlike rakuühenduste loomise protsessi uurimine, mille abil on võimalik läbi viia kultuurtaimede rakkudes ja kudedes lämmastikku siduvate organismide elutegevust. Endo- ja eksosümbiootilist tüüpi ühendused. Populatsioonide loomise eesmärk.

esitlus, lisatud 18.03.2015


Keskkonna niiskuse väärtus ensüümide kasvatamisel lahtisel söötmel. Mikroskoopiliste seente kultuuride aeratsiooniastme mõju. Söötme koostise ja kasvatamise kestuse mõju lipaasi biosünteesile. Põllukultuuride töötlemise ja kasvatamise meetodid.

esitlus, lisatud 19.03.2015


esitlus, lisatud 23.02.2014


Mikrovetikate puhaskultuuride eraldamise meetodid ja nende identifitseerimise meetodid. Euglena glacilis'e puhaskultuuri eraldamine; rakkude elujõulisuse määramise meetodite kaalumine. Uurida hingamise ja ATP sünteesi lahtiühendajate mõju rakkude liikuvusele.

lõputöö, lisatud 24.05.2012


Viirusevastase immuunsuse spetsiifilised tegurid ja spetsiifilise antigeeni vastaste antikehade süntees. Mälurakud ja immuunvastuse väljastamine antikehade biosünteesi vormis. Lindude ja pangoliinide nakkusliku bronhiidi levik. Viiruste kasvatamine rakkudes.

test, lisatud 17.11.2010


Rakutehnoloogiate rakendamine sordiaretuses. In vitro meetodite kasutamine kaughübridisatsioonis. Töötab kalluse kasvatamisega, et saada uut aretusmaterjali. Somaatiliste rakkude hübridisatsioon ja selle peamised tulemused.