A. Interferoonid (IFN):

1. Loomulik IFN (1 põlvkond):

2. Rekombinantne IFN (2. põlvkond):

a) lühike tegevus:

IFN a2b: intron-A

IFN β: Avonex ja teised.

(pegüleeritud IFN): peginterferoon

B. Interferooni indutseerijad (interferonogeenid):

1. Sünteetiline- tsükloferoon, tiloroon, dibasool ja jne.

2. Loomulik- ridostiin jne.

AT. Interleukiinid : rekombinantne interleukiin-2 (ronkoleukiin, aldesleukiin, proleukiin, ) , rekombinantne interleukiin 1-beeta (betaleukiin).

G. kolooniaid stimuleerivad tegurid (molgrammimine jne)

Peptiidipreparaadid

Tüümuse peptiidi preparaadid .

Harknääre poolt toodetud peptiidiühendid stimuleerida T-lümfotsüütide küpsemist(tymopoetiinid).

Algselt madalate tasemete korral suurendavad tüüpiliste peptiidide preparaadid T-rakkude arvu ja nende funktsionaalset aktiivsust.

Esimese põlvkonna tüümuse preparaatide asutaja Venemaal oli Taktivin, mis on veiste harknäärest ekstraheeritud peptiidide kompleks. Tüümuse peptiidide komplekspreparaadid hõlmavad ka Timalin, Timoptin ja teised, ja need, mis sisaldavad harknääre ekstrakte - Timimulin ja Vilozen.

Veise tüümuse peptiidide preparaadid tümaliin, tüstimuliin manustada intramuskulaarselt ja taktiviin, timoptiin- naha alla, peamiselt rakulise immuunsuse puudulikkuse korral:

T-immuunpuudulikkusega,

viirusinfektsioonid,

Infektsioonide ennetamiseks kasvajate kiiritusravi ja keemiaravi ajal.

Esimese põlvkonna tüümuse preparaatide kliinilises efektiivsuses pole kahtlust, kuid neil on üks puudus: need on jagamatu segu bioloogiliselt aktiivsetest peptiididest, mida on üsna raske standardida.

Tüümuse päritolu ravimite valdkonnas tehti edusamme II ja III põlvkonna ravimite - looduslike tüümuse hormoonide sünteetiliste analoogide või nende hormoonide bioloogilise aktiivsusega fragmentide loomisel.

Kaasaegne ravim immunofaan - heksapeptiidi, tümopoetiini aktiivse tsentri sünteetilist analoogi, kasutatakse immuunpuudulikkuse, kasvajate korral. Ravim stimuleerib IL-2 moodustumist immunokompetentsete rakkude poolt, suurendab lümfoidrakkude tundlikkust selle lümfokiini suhtes, vähendab TNF (kasvaja nekroosifaktori) tootmist, omab regulatiivset toimet immuunmediaatorite (põletik) ja immunoglobuliinide tootmisele.

Luuüdi peptiidipreparaadid

Müelopiidid saadud imetajate (vasikad, sead) luuüdirakkude kultuurist. Ravimi toimemehhanism on seotud B- ja T-rakkude proliferatsiooni ja funktsionaalse aktiivsuse stimuleerimisega.

Organismis on selle ravimi sihtmärk B-lümfotsüüdid. Immuno- või hematopoeesi rikkudes põhjustab müelopiidi sisseviimine luuüdi rakkude üldise mitootilise aktiivsuse suurenemist ja nende diferentseerumise suunda küpsete B-lümfotsüütide suunas.

Müelopiidi kasutatakse humoraalse immuunsuse domineeriva kahjustusega sekundaarsete immuunpuudulikkuse seisundite kompleksravis, nakkuslike komplikatsioonide ennetamiseks pärast kirurgilisi sekkumisi, vigastusi, osteomüeliidi, mittespetsiifilisi kopsuhaigusi, kroonilist püodermat. Ravimi kõrvaltoimed on pearinglus, nõrkus, iiveldus, hüpereemia ja valulikkus süstekohas.

Kõik selle rühma ravimid on vastunäidustatud rasedatele naistele, müelopiidid ja imunofan on vastunäidustatud ema ja loote vahelise reesuskonflikti olemasolul.

Immunoglobuliini preparaadid

Inimese immunoglobuliinid

a) Immunoglobuliinid intramuskulaarseks süstimiseks

Mittespetsiifiline: normaalne inimese immunoglobuliin

Konkreetne: immunoglobuliin inimese B-hepatiidi vastu, inimese antistafülokoki immunoglobuliin, inimese teetanusevastane immunoglobuliin, inimese immunoglobuliin puukentsefaliidi vastu, inimese immunoglobuliin marutaudiviiruse vastu jne.

b) Immunoglobuliinid intravenoosseks manustamiseks

Mittespetsiifiline: normaalne inimese immunoglobuliin intravenoosseks manustamiseks (gabriglobiin, immunoveniin, intraglobiin, humaglobiin)

Konkreetne: inimese B-hepatiidi vastane immunoglobuliin (neohepatekt), pentaglobiin (sisaldab antibakteriaalset IgM, IgG, IgA), tsütomegaloviiruse vastane immunoglobuliin (cytotect), inimese immunoglobuliin puukentsefaliidi vastu, marutaudivastane IG jne.

c) Immunoglobuliinid suukaudseks manustamiseks: immunoglobuliinikompleksi preparaat (CIP) enteraalseks kasutamiseks ägedate sooleinfektsioonide korral; rotaviirusevastane immunoglobuliin suukaudseks manustamiseks.

Heteroloogilised immunoglobuliinid:

marutaudivastane immunoglobuliin hobuseseerumist, gangreenne polüvalentne hobuseseerum jne.

Mittespetsiifiliste immunoglobuliinide preparaate kasutatakse primaarse ja sekundaarse immuunpuudulikkuse korral, spetsiifiliste immunoglobuliinide preparaate - asjakohaste infektsioonide korral (terapeutilistel või profülaktilistel eesmärkidel).

Tsütokiinid ja nendel põhinevad preparaadid

Arenenud immuunvastuse reguleerimist teostavad tsütokiinid - endogeensete immunoregulatoorsete molekulide kompleks, mis on aluseks suure hulga nii looduslike kui ka rekombinantsete immunomoduleerivate ravimite loomisel.

Interferoonid (IFN):

1. Loomulik IFN (1 põlvkond):

Alfaferonid: inimese leukotsüütide IFN jne.

Beetaferoonid: inimese fibroblastiline IFN jne.

2. Rekombinantne IFN (2. põlvkond):

a) lühike tegevus:

IFN a2a: reaferon, viferon jne.

IFN a2b: intron-A

IFN β: Avonex ja teised.

b) pikaajaline toime(pegüleeritud IFN): peginterferoon (IFN a2b + polüetüleenglükool) jne.

IFN-ravimite peamine toimesuund on T-lümfotsüüdid (looduslikud tapjad ja tsütotoksilised T-lümfotsüüdid).

Looduslikud interferoonid saadakse doonorivere leukotsüütide rakkude kultuuris (lümfoblastoid- ja teiste rakkude kultuuris) indutseerija viiruse mõjul.

Rekombinantsed interferoonid saadakse geenitehnoloogia meetodil – bakteritüvede kultiveerimisel, mis sisaldavad oma geneetilises aparaadis integreeritud rekombinantset inimese interferooni geeniplasmiidi.

Interferoonidel on viirusevastane, kasvajavastane ja immunomoduleeriv toime.

Viirusevastaste ainetena on interferooni preparaadid kõige tõhusamad herpeediliste silmahaiguste (lokaalselt tilkade kujul, subkonjunktiivi kujul), herpes simplex'i, mis paikneb nahal, limaskestadel ja suguelunditel, herpes zosteri (lokaalselt hüdrogeeli kujul) ravis. -põhine salv), äge ja krooniline viirushepatiit B ja C (parenteraalselt, rektaalselt suposiitides), gripi ja SARS-i raviks ja ennetamiseks (intranasaalselt tilkade kujul). HIV-nakkuse korral normaliseerivad rekombinantsed interferoonipreparaadid immunoloogilisi parameetreid, vähendavad haiguse raskust enam kui 50% juhtudest, põhjustavad vireemia taseme ja haiguse seerumimarkerite sisalduse vähenemist. AIDS-i korral viiakse läbi kombineeritud ravi asidotümidiiniga.

Interferooni preparaatide kasvajavastane toime on seotud proliferatsioonivastase toimega ja looduslike tapjate aktiivsuse stimuleerimisega. Kasvajavastaste ainetena kasutatakse IFN-alfat, IFN-alfa-2a-t, IFN-alfa-2b-d, IFN-alfa-n1-d, IFN-beetat.

IFN-beeta-lb kasutatakse immunomodulaatorina hulgiskleroosi korral.

Interferooni preparaadid põhjustavad sarnaseid kõrvalmõjud. Iseloomulik - gripilaadne sündroom; muutused kesknärvisüsteemi küljelt: pearinglus, ähmane nägemine, segasus, depressioon, unetus, paresteesia, treemor. Seedetraktist: isutus, iiveldus; südame-veresoonkonna süsteemist on võimalikud südamepuudulikkuse sümptomid; kuseteede süsteemist - proteinuuria; vereloomesüsteemist - mööduv leukopeenia. Võib esineda ka lööve, sügelus, alopeetsia, ajutine impotentsus, ninaverejooks.

Interferooni indutseerijad (interferonogeenid):

1. Sünteetiline - tsükloferoon, tiloroon, poludaan jne.

2. Loomulik - ridostiin jne.

Interferooni induktorid on ravimid, mis suurendavad endogeense interferooni sünteesi. Nendel ravimitel on rekombinantsete interferoonide ees mitmeid eeliseid. Neil puudub antigeenne toime. Endogeense interferooni stimuleeritud süntees ei põhjusta hüperinterferoneemiat.

Tiloron(amiksiin) viitab madala molekulmassiga sünteetilistele ühenditele, on suukaudne interferooni indutseerija. Sellel on lai spekter viirusevastast toimet DNA ja RNA viiruste vastu. Viirusevastase ja immunomoduleeriva ainena kasutatakse seda gripi, SARS-i, A-hepatiidi ennetamiseks ja raviks, viirusliku hepatiidi, herpes simplexi (sh urogenitaal-) ja vöötohatise raviks, klamüüdiainfektsioonide, neuroviirus- ja neuroviirusnakkuste kompleksravis. nakkus-allergilised haigused, sekundaarse immuunpuudulikkusega. Ravim on hästi talutav. Võimalik düspepsia, lühiajalised külmavärinad, suurenenud üldine toonus, mis ei nõua ravimi katkestamist.

Poludan on polüadenüül- ja polüuridüülhapete (ekvimolaarsetes vahekordades) biosünteetiline polüribonukleotiidide kompleks. Ravimil on herpes simplex-viiruste suhtes väljendunud pärssiv toime. Seda kasutatakse silmatilkade ja süstide kujul konjunktiivi alla. Ravim on ette nähtud täiskasvanutele viiruslike silmahaiguste raviks: herpeetiline ja adenoviiruslik konjunktiviit, keratokonjunktiviit, keratiit ja keratoiridotsükliit (keratouveiit), iridotsükliit, korioretiniit, optiline neuriit.

Kõrvalmõjud esinevad harva ja väljenduvad allergiliste reaktsioonide tekkes: sügelus ja võõrkeha tunne silmas.

Tsükloferoon- madala molekulmassiga interferooni indutseerija. Sellel on viirusevastane, immunomoduleeriv ja põletikuvastane toime. Cycloferon on efektiivne puukentsefaliidi, herpese, tsütomegaloviiruse, HIV jt viiruste vastu.On klamüüdiavastane toime. Efektiivne süsteemsete sidekoehaiguste korral. Kinnitati ravimi radioprotektiivne ja põletikuvastane toime.

Arbidol on ette nähtud suukaudselt gripi ja teiste ägedate hingamisteede viirusnakkuste, samuti herpeediliste haiguste ennetamiseks ja raviks.

Interleukiinid:

rekombinantne IL-2 (aldesleukiin, proleukiin, ronkoleukiin ) , rekombinantne IL-1beeta ( betaleykin).

Loodusliku päritoluga tsütokiinipreparaate, mis sisaldavad piisavalt suurt hulka põletiku tsütokiine ja immuunvastuse esimest faasi, iseloomustab mitmekülgne toime inimkehale. Need ravimid toimivad rakkudele, mis osalevad põletikus, regeneratsiooniprotsessides ja immuunvastusest.

Aldesleukin- IL-2 rekombinantne analoog. Sellel on immunomoduleeriv ja kasvajavastane toime. Aktiveerib rakulise immuunsuse. Parandab T-lümfotsüütide ja IL-2-sõltuvate rakupopulatsioonide proliferatsiooni. Suurendab kasvajarakke ära tundvate ja hävitavate lümfotsüütide ja tapjarakkude tsütotoksilisust. Suurendab gamma-interferooni, TNF, IL-1 tootmist. Kasutatakse neeruvähi korral.

Betaleukiin- inimese rekombinantne IL-1 beeta. Stimuleerib leukopoeesi ja immuunkaitset. Seda manustatakse naha alla või intravenoosselt mädaste protsesside korral immuunpuudulikkuse, keemiaravi tagajärjel tekkinud leukopeenia ja kasvajate korral.

Roncoleukin- interleukiin-2 rekombinantne preparaat - manustatakse intravenoosselt immuunpuudulikkusega sepsise, samuti neeruvähi korral.

Kolooniaid stimuleerivad tegurid:

Molgramostim(Leikomax) on inimese granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriva faktori rekombinantne preparaat. Stimuleerib leukopoeesi, omab immunotroopset aktiivsust. See suurendab prekursorite proliferatsiooni ja diferentseerumist, suurendab küpsete rakkude sisaldust perifeerses veres, granulotsüütide, monotsüütide, makrofaagide kasvu. Suurendab küpsete neutrofiilide funktsionaalset aktiivsust, suurendab fagotsütoosi ja oksüdatiivset metabolismi, pakkudes fagotsütoosi mehhanisme, suurendab tsütotoksilisust pahaloomuliste rakkude vastu.

Filgrastiim(Neupogen) on inimese granulotsüütide kolooniaid stimuleeriva faktori rekombinantne preparaat. Filgrastiim reguleerib neutrofiilide tootmist ja nende sisenemist luuüdist verre.

Lenograstim- inimese granulotsüütide kolooniaid stimuleeriva faktori rekombinantne preparaat. See on kõrgelt puhastatud valk. See on immunomodulaator ja leukopoeesi stimulaator.

Sünteetilised immunostimulaatorid: levamisool, polüoksidooniumsoprinosiin, galavit.

Levamisool(decaris), imidasooli derivaati, kasutatakse immunostimulaatorina, samuti antihelmintia vahendina askariaas. Levamisooli immunostimuleerivad omadused on seotud makrofaagide ja T-lümfotsüütide aktiivsuse suurenemisega.

Levamisooli määratakse suu kaudu korduvate herpeediliste infektsioonide, kroonilise viirushepatiidi, autoimmuunhaiguste (reumatoidartriit, süsteemne erütematoosluupus, Crohni tõbi) korral. Ravimit kasutatakse ka jämesoole kasvajate korral pärast kasvajate kirurgilist, kiiritus- või medikamentoosset ravi.

Isoprinosiin- inosiini sisaldav ravim. Stimuleerib makrofaagide aktiivsust, interleukiinide tootmist, T-lümfotsüütide proliferatsiooni.

Määrake sees viirusnakkuste, hingamisteede ja kuseteede krooniliste infektsioonide, immuunpuudulikkuse korral.

Polüoksidoonium- sünteetiline vees lahustuv polümeerühend. Ravimil on immunostimuleeriv ja detoksifitseeriv toime, see suurendab organismi immuunresistentsust kohalike ja üldiste infektsioonide vastu. Polüoksidoonium aktiveerib kõik loodusliku resistentsuse tegurid: monotsüütide-makrofaagide süsteemi rakud, neutrofiilid ja looduslikud tapjad, suurendades nende funktsionaalset aktiivsust algselt alandatud tasemel.

Galavit on ftalhüdrasiidi derivaat. Selle ravimi eripära on mitte ainult immunomoduleerivate, vaid ka väljendunud põletikuvastaste omaduste olemasolu.

Immunostimuleeriva toimega teiste farmakoloogiliste klasside ravimid

1. Adaptogeenid ja taimsed preparaadid (fütopreparaadid): Echinacea (immunal), eleutherococcus, ženšenni, rhodiola rosea jne preparaadid.

2. Vitamiinid: askorbiinhape (C-vitamiin), tokoferoolatsetaat (E-vitamiin), retinoolatsetaat (A-vitamiin) (vt lõik "Vitamiinid").

Echinacea preparaadid neil on immunostimuleerivad ja põletikuvastased omadused. Suukaudsel manustamisel suurendavad need ravimid makrofaagide ja neutrofiilide fagotsüütilist aktiivsust, stimuleerivad interleukiin-1 tootmist, T-abistajate aktiivsust ja B-lümfotsüütide diferentseerumist.

Echinacea preparaate kasutatakse immuunpuudulikkuse ja krooniliste põletikuliste haiguste korral. Eriti, immuunne manustatakse suu kaudu tilkade kujul ägedate hingamisteede infektsioonide ennetamiseks ja raviks, samuti koos antibakteriaalsete ainetega naha-, hingamisteede ja kuseteede infektsioonide korral.

Immunostimulantide kasutamise üldpõhimõtted sekundaarse immuunpuudulikkusega patsientidel

Immunostimulantide kõige mõistlikum kasutamine näib olevat immuunpuudulikkuse korral, mis väljendub suurenenud nakkushaigestumuses. Immunostimuleerivate ravimite peamiseks sihtmärgiks jäävad sekundaarsed immuunpuudulikkused, mis väljenduvad sagedaste korduvate, raskesti ravitavate, igasuguse lokaliseerimise ja mis tahes etioloogiaga nakkus- ja põletikuliste haigustena. Iga kroonilise nakkus- ja põletikulise protsessi keskmes on muutused immuunsüsteemis, mis on selle protsessi püsimise üheks põhjuseks.

Immunomodulaatorid määratakse kompleksravis samaaegselt antibiootikumide, seenevastaste, algloomadevastaste või viirusevastaste ainetega.

· Immunorehabilitatsioonimeetmete läbiviimisel, eriti mittetäieliku paranemise korral pärast ägedat nakkushaigust, võib monoteraapiana kasutada immunomodulaatoreid.

· Soovitatav on kasutada immunomodulaatoreid immunoloogilise monitooringu taustal, mida tuleks läbi viia sõltumata esmaste immuunsüsteemi muutuste olemasolust või puudumisest.

Immuunsuse fagotsüütilisele lülile mõjuvaid immunomodulaatoreid võib määrata nii tuvastatud kui ka diagnoosimata immuunseisundi häiretega patsientidele, s.t. nende kasutamise aluseks on kliiniline pilt.

Immuunsuse mis tahes parameetri vähenemine, mis ilmnes immuundiagnostilise uuringu käigus praktiliselt tervel inimesel, mitte tingimata on immunomoduleeriva ravi määramise aluseks.

Testi küsimused:

1. Mis on immunostimulaatorid, millised on immunoteraapia näidustused, millisteks immuunpuudulikkuse seisunditeks jagunevad?

2. Immunomodulaatorite klassifikatsioon toime eelisselektiivsuse järgi?

3. Mikroobse päritoluga immunostimulaatorid ja nende sünteetilised analoogid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

4. Endogeensed immunostimulaatorid ja nende sünteetilised analoogid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

5. Tüümuse peptiidide ja luuüdi peptiidide preparaadid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

6. Immunoglobuliinipreparaadid ja interferoonid (IFN), nende farmakoloogilised omadused, näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

7. Interferooni indutseerijate (interferonogeenide) preparaadid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

8. Interleukiinide ja kolooniaid stimuleerivate faktorite preparaadid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

9. Sünteetilised immunostimulaatorid, nende farmakoloogilised omadused, näidustused, vastunäidustused, kõrvaltoimed?

10. Immunostimuleeriva toimega teiste farmakoloogiliste klasside ravimid ja immunostimulantide kasutamise üldpõhimõtted sekundaarse immuunpuudulikkusega patsientidel?

Tsütokiinid on oma olemuselt immuunsüsteemi rakkude poolt toodetud valgud (kirjanduses nimetatakse neid sageli "faktoriteks"). Nad osalevad immuunsüsteemi vastsündinud rakkude diferentseerumises, andes neile teatud tunnused, mis on immuunrakkude mitmekesisuse allikaks, ja pakuvad ka rakkudevahelist interaktsiooni. Selle protsessi lihtsamaks mõistmiseks võime võrrelda immuunrakkude tootmist tehasega. Esimeses etapis tulevad konveierilt maha identsed raku toorikud, siis teises etapis antakse igale rakule erinevate tsütokiinirühmade abil erifunktsioonid ja need sorteeritakse rühmadesse, et osaleda immuunprotsessides. Nii saadakse identsetest rakkudest T-lümfotsüüdid, B-lümfotsüüdid, neutrofiilid, basofiilid, eosinofiilid, monotsüüdid.

Teadusele pakub huvi tsütokiini mõju omapära rakule, mis tekitab selles rakus teiste tsütokiinide tootmist. See tähendab, et üks tsütokiin käivitab teiste tootmise tsütokiinid.

Tsütokiinid jagunevad olenevalt toimest immuunrakkudele kuue rühma:

• Interferoonid
• Interleukiinid
• kolooniaid stimuleerivad tegurid
• kasvufaktorid
• Kemokiinid
• Kasvaja nekroosi tegurid

Interferoonid on tsütokiinid, mida rakud toodavad vastusena viirusinfektsioonile või muudele stiimulitele. Need valgud (tsütokiinid) blokeerivad viiruse paljunemist teistes rakkudes ja osalevad immuunsüsteemi rakkudevahelises interaktsioonis.

Esimene tüüp (on viirusevastane ja kasvajavastane toime):

interferoon-alfa

interferoon-beeta

Interferoon-gamma

Interferoonidel alfa ja beeta on sarnane toimemehhanism, kuid neid toodavad erinevad rakud.

Interferoon-alfat toodavad mononukleaarsed fagotsüüdid. Sellest tuleneb selle nimi - " leukotsüütide interferoon».

Interferoon-beetat toodavad fibroblastid. Sellest ka selle nimi - fibroblastide interferoon».

Esimest tüüpi interferoonidel on oma ülesanded:

• Suurendada interleukiinide (IL1) tootmist
• Temperatuuri tõusuga langetage pH taset rakkudevahelises keskkonnas
• Seondub tervete rakkudega ja kaitseb neid viiruste eest
• Võimeline pärssima rakkude proliferatsiooni (kasvu), blokeerides aminohapete sünteesi
• Koos looduslike tapjarakkudega kutsuvad nad esile või pärsivad (olenevalt olukorrast) antigeenide moodustumist

Gamma-interferooni toodavad T-lümfotsüüdid ja looduslikud tapjarakud. kannab nime - immuunne interferoon»

Teist tüüpi interferoonil on ka ülesanded:

• Aktiveerib T-lümfotsüüdid, B-lümfotsüüdid, makrofaagid, neutrofiilid,
• Inhibeerib tümotsüütide proliferatsiooni,
• Tugevdab rakulist immuunsust ja autoimmuunsust,
• Reguleerib normaalsete ja nakatunud rakkude apoptoosi.

Interleukiinid(lühendatult IL) on tsütokiinid, mis reguleerivad leukotsüütide vahelist interaktsiooni. Teadus on tuvastanud 27 interleukiini.

kolooniaid stimuleerivad tegurid on tsütokiinid, mis reguleerivad luuüdi tüvirakkude ja vererakkude prekursorite jagunemist ja diferentseerumist. Need tsütokiinid vastutavad lümfotsüütide kloonimisvõime eest ja on samuti võimelised stimuleerima väljaspool luuüdi olevate rakkude funktsionaalsust.

Kasvufaktorid – reguleerivad rakkude kasvu, diferentseerumist ja funktsionaalsust erinevates kudedes

Praeguseks on avastatud järgmised kasvufaktorid:

• transformeerivad kasvufaktorid alfa ja beeta
• epidermise kasvufaktor
• fibroblastide kasvufaktor
• trombotsüütide kasvufaktor
• närvi kasvufaktor
• insuliinitaoline kasvufaktor
• hepariini siduv kasvufaktor
• endoteelirakkude kasvufaktor

Enim uuritud on kasvufaktori beeta muundamise funktsioone. See vastutab T-lümfotsüütide kasvu ja aktiivsuse pärssimise eest, inhibeerib mõningaid makrofaagide, neutrofiilide, B-lümfotsüütide funktsioone. Kuigi see tegur viitab kasvufaktoritele, osaleb see tegelikult pöördprotsessides, st pärsib immuunvastust (pärsib immuunkaitses osalevate rakkude funktsioone), kui infektsioon on elimineeritud ja immuunrakkude tööd. pole enam vajalik. Just selle teguri mõjul paraneb haavade paranemise ajal kollageeni süntees ja IgA immunoglobuliini tootmine ning tekivad mälurakud.

Kemokiinid on madala molekulmassiga tsütokiinid. Nende põhiülesanne on leukotsüütide tõmbamine vereringest põletikukoldesse, samuti leukotsüütide liikuvuse reguleerimine.

Kasvaja nekroosi tegurid(lühendatult TNF) on kahte tüüpi tsütokiine (TNF-alfa ja TNF-beeta). Nende toime tulemused: kahheksia tekkimine (organismi äärmine kurnatus selle tagajärjel aeglustab ensüümi aktiivsust, mis aitab kaasa rasva kogunemisele kehas); toksilise šoki tekkimine; immuunsüsteemi rakkude apoptoosi (rakusurma) pärssimine, kasvaja ja teiste rakkude apoptoosi esilekutsumine; trombotsüütide aktiveerimine ja haavade paranemine; angiogeneesi (veresoonte proliferatsioon) ja fibrogeneesi (koe degenereerumine sidekoeks), granulomatoosi (granuloomide moodustumine - fagotsüütide proliferatsioon ja transformatsioon) ja paljude teiste tulemuste pärssimine.

Selles peatükis käsitletakse integreeritud lähenemist tsütokiinisüsteemi hindamisele, kasutades eelnevalt kirjeldatud kaasaegseid uurimismeetodeid.

Esiteks kirjeldame tsütokiinisüsteemi põhikontseptsioone.

Tsütokiine peetakse praegu valk-peptiidmolekulideks, mida toodavad erinevad keharakud ja mis viivad läbi rakkudevahelisi ja süsteemidevahelisi interaktsioone. Tsütokiinid on rakkude elutsükli universaalsed regulaatorid, mis juhivad viimaste diferentseerumise, proliferatsiooni, funktsionaalse aktivatsiooni ja apoptoosi protsesse.

Immuunsüsteemi rakkude poolt toodetud tsütokiine nimetatakse immunotsütokiinideks; nad esindavad immuunsüsteemi lahustuvate peptiidide vahendajate klassi, mis on vajalikud selle arenguks, toimimiseks ja koostoimeks teiste kehasüsteemidega (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Reguleerivate molekulidena mängivad tsütokiinid olulist rolli kaasasündinud ja adaptiivsete immuunsusreaktsioonide elluviimisel, tagavad nende omavahelise seose, kontrollivad vereloomet, põletikke, haavade paranemist, uute veresoonte teket (angiogenees) ja paljusid muid elutähtsaid protsesse.

Praegu on tsütokiinidel mitu erinevat klassifikatsiooni, võttes arvesse nende struktuuri, funktsionaalset aktiivsust, päritolu ja tsütokiini retseptorite tüüpi. Traditsiooniliselt, vastavalt bioloogilistele mõjudele, on tavaks eristada järgmisi tsütokiinide rühmi.

1. Interleukiinid(IL-1-IL-33) - immuunsüsteemi sekretoorset reguleerivat valgud, mis tagavad vahendajate interaktsioonid immuunsüsteemis ja selle ühenduse teiste kehasüsteemidega. Interleukiinid jagunevad funktsionaalse aktiivsuse järgi pro- ja põletikuvastasteks tsütokiinideks, lümfotsüütide kasvufaktoriteks, regulatoorseteks tsütokiinideks jne.

3. Kasvaja nekroosifaktorid (TNF)- tsütotoksilise ja reguleeriva toimega tsütokiinid: TNFa ja lümfotoksiinid (LT).

4. Hematopoeetiliste rakkude kasvufaktorid- tüvirakkude kasvufaktor (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, erütropoetiin, trobopoetiin, granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor - GM-CSF, granulotsüütne CSF - G-CSF, makrofaag-

ny KSF – M-CSF).

5. Kemokiinid- С, СС, СХС (IL-8), СХ3С - erinevate rakutüüpide kemotaksise regulaatorid.

6. Mitte-lümfoidsete rakkude kasvufaktorid- erinevate koega seotud rakkude kasvu, diferentseerumise ja funktsionaalse aktiivsuse regulaatorid (fibroblastide kasvufaktor - FGF, endoteelirakkude kasvufaktor, epidermaalne kasvufaktor - epidermaalne EGF) ja transformeerivad kasvufaktorid (TGFβ, TGFα).

Muuhulgas on viimastel aastatel aktiivselt uuritud makrofaagide migratsiooni pärssivat tegurit (migratsiooni inhibeeriv faktor – MIF), mida peetakse tsütokiinide ja ensüümide aktiivsusega neurohormooniks (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Tsütokiinid erinevad struktuuri, bioloogilise aktiivsuse ja muude omaduste poolest. Kuid koos erinevustega on tsütokiinidel üldised omadused, iseloomulik sellele bioregulatoorsete molekulide klassile.

1. Tsütokiinid on reeglina keskmise molekulmassiga (alla 30 kD) glükosüülitud polüpeptiidid.

2. Tsütokiine toodavad immuunsüsteemi rakud ja teised rakud (näiteks endoteel, fibroblastid jne) vastusena aktiveerivale stiimulile (patogeeniga seotud molekulaarstruktuurid, antigeenid, tsütokiinid jne) ning nad osalevad reaktsioonides. kaasasündinud ja kohanemisvõimeline immuunsus, reguleerides nende tugevust ja kestust. Mõned tsütokiinid sünteesitakse konstitutiivselt.

3. Tsütokiinide sekretsioon on lühike protsess. Tsütokiinid ei püsi eelvormitud molekulidena, vaid pigem

süntees algab alati geenide transkriptsiooniga. Rakud toodavad tsütokiine madalates kontsentratsioonides (pikogrammi milliliitri kohta).

4. Enamikul juhtudel toodetakse tsütokiine ja need toimivad vahetus läheduses asuvatele sihtrakkudele (lühitoime). Tsütokiinide peamine toimekoht on rakkudevaheline sünaps.

5. Koondamine Tsütokiinisüsteem avaldub selles, et iga rakutüüp on võimeline tootma mitut tsütokiini ja iga tsütokiini võivad eritada erinevad rakud.

6. Kõiki tsütokiine iseloomustatakse pleiotroopia, või tegevuse multifunktsionaalsus. Seega on põletikunähtude ilmnemine tingitud IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 mõjust. Funktsioonide dubleerimine tagab tsütokiinisüsteemi töökindluse.

7. Tsütokiinide toimet sihtrakkudele vahendavad väga spetsiifilised kõrge afiinsusega membraaniretseptorid, mis on transmembraansed glükoproteiinid, mis koosnevad tavaliselt rohkem kui ühest subühikust. Tsütokiinide sidumise eest vastutab retseptorite rakuväline osa. On retseptoreid, mis kõrvaldavad patoloogilises fookuses liigsed tsütokiinid. Need on niinimetatud peibutusretseptorid. Lahustuvad retseptorid on membraaniretseptori rakuväline domeen, mis on eraldatud ensüümiga. Lahustuvad retseptorid on võimelised neutraliseerima tsütokiine, osalema nende transpordis põletikukoldesse ja organismist väljutamisel.

8. Tsütokiinid töötavad nagu võrk. Nad võivad tegutseda koos. Paljud funktsioonid, mis algselt omistati ühele tsütokiinile, näivad olevat tingitud mitme tsütokiini kooskõlastatud tegevusest. (sünergism toimingud). Tsütokiinide sünergilise interaktsiooni näideteks on põletikuliste reaktsioonide (IL-1, IL-6 ja TNFa) stimuleerimine, samuti IgE süntees

(IL-4, IL-5 ja IL-13).

Mõned tsütokiinid indutseerivad teiste tsütokiinide sünteesi (kaskaad). Tsütokiinide kaskaadne toime on vajalik põletikuliste ja immuunvastuste tekkeks. Mõnede tsütokiinide võime suurendada või vähendada teiste tootmist määrab olulised positiivsed ja negatiivsed regulatsioonimehhanismid.

Tsütokiinide antagonistlik toime on teada, näiteks IL-6 tootmine vastusena TNF-a kontsentratsiooni suurenemisele võib olla

negatiivne regulatiivne mehhanism selle vahendaja tootmise kontrollimiseks põletiku ajal.

Sihtrakkude funktsioonide tsütokiinide reguleerimine toimub autokriinsete, parakriinsete või endokriinsete mehhanismide abil. Mõned tsütokiinid (IL-1, IL-6, TNFα jne) on võimelised osalema kõigi ülaltoodud mehhanismide rakendamises.

Raku reaktsioon tsütokiini mõjule sõltub mitmest tegurist:

Rakkude tüübist ja nende esialgsest funktsionaalsest aktiivsusest;

Tsütokiini kohalikust kontsentratsioonist;

Teiste vahendaja molekulide olemasolust.

Seega moodustavad sihtrakkude produtseerivad rakud, tsütokiinid ja nende spetsiifilised retseptorid ühtse vahendajavõrgu. See on reguleerivate peptiidide kogum, mitte üksikud tsütokiinid, mis määravad raku lõpliku vastuse. Praegu käsitletakse tsütokiinisüsteemi kui universaalset regulatsioonisüsteemi kogu organismi tasandil, mis tagab kaitsereaktsioonide tekke (näiteks nakatumise ajal).

Viimastel aastatel on tekkinud idee tsütokiinide süsteemist, mis ühendab:

1) tootjarakud;

2) lahustuvad tsütokiinid ja nende antagonistid;

3) sihtrakud ja nende retseptorid (joonis 7.1).

Tsütokiinisüsteemi erinevate komponentide rikkumised põhjustavad arvukate patoloogiliste protsesside arengut ja seetõttu on selle regulatsioonisüsteemi defektide tuvastamine oluline õigeks diagnoosimiseks ja piisava ravi määramiseks.

Vaatleme kõigepealt tsütokiinisüsteemi põhikomponente.

Tsütokiine tootvad rakud

I. Adaptiivse immuunvastuse käigus tsütokiine tootvate rakkude peamine rühm on lümfotsüüdid. Puhkavad rakud ei erita tsütokiine. Antigeeni äratundmisel ja retseptori interaktsioonide (CD28-CD80/86 T-lümfotsüütide ja CD40-CD40L B-lümfotsüütide puhul) osalusel toimub raku aktivatsioon, mis viib tsütokiini geenide transkriptsioonini, translatsioonini ja glükosüülitud peptiidide sekretsioonini. rakuvälisesse ruumi.

Riis. 7.1. Tsütokiini süsteem

CD4 T-abistajaid esindavad alampopulatsioonid: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, mis erinevad üksteisest vastusena erinevatele antigeenidele sekreteeritud tsütokiinide spektri poolest.

Th0 toodab laias valikus tsütokiine väga madalatel kontsentratsioonidel.

Diferentseerumise suund Th0 määrab kahe immuunvastuse vormi kujunemise, kus domineerivad humoraalsed või rakulised mehhanismid.

Antigeeni olemus, selle kontsentratsioon, lokaliseerimine rakus, antigeeni esitlevate rakkude tüüp ja teatud tsütokiinide komplekt reguleerivad Th0 diferentseerumise suunda.

Dendriitrakud esitavad pärast antigeeni püüdmist ja töötlemist Th0-rakkudele antigeenseid peptiide ja toodavad tsütokiine, mis reguleerivad nende efektorrakkudeks diferentseerumise suunda. Üksikute tsütokiinide roll selles protsessis on näidatud joonisel fig. 7.2. IL-12 indutseerib IFNy sünteesi T-lümfotsüütide ja ]ChGK poolt. IFNu tagab Th1 diferentseerumise, mis hakkab sekreteerima tsütokiine (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, lümfotoksiinid), mis reguleerivad reaktsioonide teket rakusiseste patogeenide suhtes.

(hilinenud tüüpi ülitundlikkus (DTH) ja mitmesugused raku tsütotoksilisuse tüübid).

IL-4 tagab Th0 diferentseerumise Th2-ks. Aktiveeritud Th2 toodab tsütokiine (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 jne), mis määravad B-lümfotsüütide proliferatsiooni, nende edasise diferentseerumise plasmarakkudeks ja antikehade vastuste tekke, peamiselt rakuvälised patogeenid.

IFNy reguleerib negatiivselt Th2 rakkude funktsiooni ja vastupidi, Th2 poolt sekreteeritud IL-4, IL-10 inhibeerivad Th1 funktsiooni (joonis 7.3). Selle regulatsiooni molekulaarne mehhanism on seotud transkriptsioonifaktoritega. IFNy poolt määratud T-bet ja STAT4 ekspressioon suunab T-rakkude diferentseerumist mööda Th1 rada ja pärsib Th2 arengut. IL-4 indutseerib GATA-3 ja STAT6 ekspressiooni, mis vastavalt tagab naiivse Th0 muundumise Th2 rakkudeks (joonis 7.2).

Viimastel aastatel on kirjeldatud IL-17 tootvate T-abistajarakkude (Th17) selget alampopulatsiooni. IL-17 perekonna liikmeid võivad ekspresseerida aktiveeritud mälurakud (CD4 CD45RO), y5T-rakud, NKT-rakud, neutrofiilid, monotsüüdid IL-23, IL-6, makrofaagide ja dendriitrakkude poolt toodetud TGFβ mõjul. ROR-C on peamine diferentseerumistegur inimestel ja ROR-γ hiirtel. l Näidati IL-17 olulist rolli kroonilise põletiku ja autoimmuunpatoloogia tekkes (vt joonis 7.2).

Lisaks võivad tüümuse T-lümfotsüüdid diferentseeruda looduslikeks regulatoorseteks rakkudeks (Treg), mis ekspresseerivad CD4+ CD25+ pinnamarkereid ja FOXP3 transkriptsioonifaktorit. Need rakud on võimelised suruma alla Th1- ja Th2-rakkude poolt vahendatud immuunvastust otsese rakkudevahelise kontakti ning TGFβ ja IL-10 sünteesi kaudu.

Th0 kloonide ja nende poolt sekreteeritud tsütokiinide diferentseerumise skeemid on näidatud joonisel fig. 7.2 ja 7.3 (vt ka värvilisa).

T-tsütotoksilised rakud (CD8+), looduslikud tapjad – nõrgad tsütokiinide, nagu interferoonid, TNFa ja lümfotoksiinid, tootjad.

Ühe Th-alapopulatsiooni liigne aktiveerimine võib määrata ühe immuunvastuse variandi kujunemise. Th-aktivatsiooni krooniline tasakaalustamatus võib põhjustada immunopatoloogiliste seisundite teket, mis on seotud haiguse ilmingutega

mi allergiad, autoimmuunpatoloogia, kroonilised põletikulised protsessid jne.

Riis. 7.2. Tsütokiine tootvate T-lümfotsüütide erinevad alampopulatsioonid

II. Kaasasündinud immuunsüsteemis on peamised tsütokiinide tootjad müeloidrakud. Toll-like retseptorite (TLR) abil tunnevad nad ära erinevate patogeenide sarnased molekulaarstruktuurid, nn patogeeniga seotud molekulaarmustrid (PAMP), nt kordused jne.

See interaktsioon TLR-ga käivitab rakusisese signaaliülekande kaskaadi, mis viib geenide ekspressioonini kahes peamises tsütokiinirühmas: põletikueelse ja 1. tüüpi IFN-i jaoks (joonis 7.4, vt ka värvilisa). Enamasti kutsuvad need tsütokiinid (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, kemokiinid jt) esile põletiku teket ning osalevad organismi kaitsmises bakteriaalsete ja viirusnakkuste eest.

Riis. 7.3. Th1 ja Th12 rakkude poolt sekreteeritud tsütokiinide spekter

III. Rakud, mis ei kuulu immuunsüsteemi (sidekoe, epiteeli, endoteeli rakud), eritavad konstitutiivselt autokriinseid kasvufaktoreid (GGF, EGF, TGFr jne). ja hematopoeetiliste rakkude proliferatsiooni toetavad tsütokiinid.

Tsütokiinid ja nende antagonistid on üksikasjalikult kirjeldatud paljudes monograafiates (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Riis. 7.4. TLR-vahendatud tsütokiinide tootmise indutseerimine kaasasündinud immuunrakkude poolt

Tsütokiinide liigne ekspressioon on organismile ohtlik ja võib viia liigse põletikulise reaktsiooni ehk ägeda faasi reaktsiooni tekkeni. Põletikueelsete tsütokiinide tootmise reguleerimisse on kaasatud erinevad inhibiitorid. Seega on kirjeldatud mitmeid aineid, mis seovad mittespetsiifiliselt tsütokiini IL-1 ja takistavad selle bioloogilise toime avaldumist (a2-makroglobuliin, komplemendi C3-komponent, uromoduliin). IL-1 spetsiifilised inhibiitorid võivad olla lahustuvad peibutusretseptorid, antikehad ja IL-1 retseptori antagonist (IL-1RA). Põletiku tekkega suureneb IL-1RA geeni ekspressioon. Kuid isegi tavaliselt esineb see antagonist veres suures kontsentratsioonis (kuni 1 ng / ml või rohkem), blokeerides endogeense IL-1 toime.

sihtrakud

Tsütokiinide toimet sihtrakkudele vahendavad spetsiifilised retseptorid, mis seovad tsütokiine väga kõrge afiinsusega ning üksikud tsütokiinid võivad kasutada

ühised retseptori subühikud. Iga tsütokiin seondub oma spetsiifilise retseptoriga.

Tsütokiini retseptorid on transmembraansed valgud ja jagunevad 5 põhitüüpi. Kõige levinumad on nn vereloome tüüpi retseptorid, millel on kaks ekstratsellulaarset domeeni, millest üks sisaldab kahe trüptofaani ja seriini korduse aminohappejääkide ühist järjestust, mis on eraldatud mis tahes aminohappega (WSXWS motiiv). Teist tüüpi retseptoritel võib olla kaks ekstratsellulaarset domeeni suure hulga konserveerunud tsüsteiinidega. Need on IL-10 ja IFN perekonna retseptorid. Kolmandat tüüpi esindavad TNF rühma kuuluvad tsütokiini retseptorid. Neljas tsütokiini retseptori tüüp kuulub immunoglobuliini retseptorite superperekonda, mille ekstratsellulaarsed domeenid on struktuurilt sarnased immunoglobuliini molekulide omadega. Viiendat tüüpi retseptoreid, mis seovad kemokiinide perekonna molekule, esindavad transmembraansed valgud, mis läbivad rakumembraani 7 kohas. Tsütokiini retseptorid võivad eksisteerida lahustuval kujul, säilitades võime ligandide siduda (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Tsütokiinid on võimelised mõjutama sihtrakkude proliferatsiooni, diferentseerumist, funktsionaalset aktiivsust ja apoptoosi (vt joonis 7.1). Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse avaldumine sihtrakkudes sõltub erinevate rakusiseste süsteemide osalemisest retseptori signaaliülekandes, mis on seotud sihtrakkude omadustega. Apoptoosi signaal viiakse muuhulgas läbi TNF-i retseptorite perekonna spetsiifilise piirkonna, nn "surma" domeeni abil (joonis 7.5, vt värvilisa). Diferentseerumis- ja aktiveerimissignaalid edastatakse läbi intratsellulaarsete Jak-STAT valkude – signaalimuundurite ja transkriptsiooni aktivaatorite (joonis 7.6, vt värvilisa). G-valgud osalevad kemokiinide signaaliülekandes, mis suurendab rakkude migratsiooni ja adhesiooni.

Tsütokiinisüsteemi kompleksanalüüs hõlmab järgmist.

I. Tootmisrakkude hindamine.

1. Avaldise definitsioon:

Retseptorid, mis tunnevad ära patogeeni või TCR-i antigeeni, TLR) geenide ja valgumolekulide tasemel (PCR, voolutsütomeetria meetod);

Adaptermolekulid, mis juhivad signaali, mis käivitab tsütokiini geenide transkriptsiooni (PCR jne);

Riis. 7.5. Signaali ülekanne TNF retseptorilt

Riis. 7.6. Jak-STAT – 1. tüüpi tsütokiini retseptori signaalirada

Tsütokiini geenid (PCR); tsütokiinide valgumolekulid (inimese mononukleaarsete rakkude tsütokiine sünteesiva funktsiooni hindamine).

2. Teatud tsütokiine sisaldavate raku alampopulatsioonide kvantitatiivne määramine: Th1, Th2 Th17 (tsütokiinide intratsellulaarse värvimise meetod); teatud tsütokiine sekreteerivate rakkude arvu määramine (ELISPOT meetod, vt 4. peatükk).

II. Tsütokiinide ja nende antagonistide hindamine organismi bioloogilises keskkonnas.

1. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimine.

2. Tsütokiinide kvantitatiivne määramine ELISA abil.

3. Tsütokiinide immunohistokeemiline värvimine kudedes.

4. Vastandtsütokiinide (pro- ja põletikuvastaste), tsütokiinide ja tsütokiini retseptori antagonistide vahekorra määramine.

III. Sihtrakkude hindamine.

1. Tsütokiini retseptorite ekspressiooni määramine geenide ja valgumolekulide tasemel (PCR, voolutsütomeetria meetod).

2. Signaalmolekulide määramine intratsellulaarses sisus.

3. Sihtrakkude funktsionaalse aktiivsuse määramine.

Mitmekülgse teabe saamiseks on välja töötatud arvukalt tsütokiinisüsteemi hindamise meetodeid. Nende hulgas eristatakse:

1) molekulaarbioloogilised meetodid;

2) meetodid tsütokiinide kvantitatiivseks määramiseks immuunanalüüsi abil;

3) tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimine;

4) tsütokiinide rakusisene värvimine;

5) ELISPOT meetod, mis võimaldab tuvastada tsütokiine üksiku tsütokiini tootva raku ümber;

6) immunofluorestsents.

Kirjeldame neid meetodeid lühidalt.

Via molekulaarbioloogilised meetodid on võimalik uurida tsütokiinide geenide ekspressiooni, nende retseptoreid, signaalmolekule, uurida nende geenide polümorfismi. Viimastel aastatel on läbi viidud suur hulk uuringuid, mis on näidanud seoseid tsütokiinisüsteemi molekulide geenide alleelivariantide ja eelsoodumuse vahel.

mitmete haiguste vastu. Tsütokiini geenide alleelsete variantide uurimine võib anda teavet konkreetse tsütokiini geneetiliselt programmeeritud tootmise kohta. Kõige tundlikum on reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon – PCR-RT (vt ptk. 6). hübridisatsiooni meetod kohapeal võimaldab selgitada tsütokiini geenide ekspressiooni kudede ja raku lokaliseerimist.

Tsütokiinide kvantitatiivset määramist bioloogilistes vedelikes ja perifeerse vere mononukleaarsete rakkude kultuurides ELISA abil saab iseloomustada järgmiselt. Kuna tsütokiinid on lokaalsed vahendajad, on õigem mõõta nende taset vastavates kudedes pärast koevalgu ekstraheerimist või looduslikes vedelikes nagu pisar, suuloputus, uriin, lootevesi, tserebrospinaalvedelik jne. Tsütokiinide tase seerumis või teistes kehavedelikes peegeldab immuunsüsteemi hetkeseisu, s.t. tsütokiinide süntees keharakkude poolt in vivo.

Perifeerse vere mononukleaarsete rakkude (PBMC) tsütokiinide tootmise taseme määramine näitab rakkude funktsionaalset seisundit. MNC tsütokiinide spontaanne tootmine kultuuris näitab, et rakud on juba aktiveeritud. in vivo. Indutseeritud (erinevate stimulantide, mitogeenide poolt) tsütokiinide süntees peegeldab rakkude potentsiaali, varuvõimet reageerida antigeensele stiimulile (eriti ravimite toimele). Tsütokiinide vähenenud indutseeritud tootmine võib olla üks immuunpuudulikkuse seisundi tunnuseid. Tsütokiinid ei ole konkreetse antigeeni suhtes spetsiifilised. Seetõttu on nakkus-, autoimmuun- ja allergiliste haiguste spetsiifiline diagnoosimine teatud tsütokiinide taseme määramise teel võimatu. Samas võimaldab tsütokiinide taseme hindamine saada andmeid põletikulise protsessi raskusastme, selle ülemineku kohta süsteemsele tasemele ja prognoosi, immuunsüsteemi rakkude funktsionaalse aktiivsuse ning Th1 ja Th2 rakkude vahekorra kohta. mis on väga oluline mitmete nakkuslike ja immunopatoloogiliste protsesside diferentsiaaldiagnostikas.

Bioloogilises keskkonnas saab tsütokiine kvantifitseerida, kasutades erinevaid immuunanalüüsi meetodid, kasutades polüklonaalseid ja monoklonaalseid antikehi (vt ptk 4). ELISA võimaldab teil teada saada, millised on tsütokiinide täpsed kontsentratsioonid bio-

loogilised kehavedelikud. ELISA tsütokiinide tuvastamisel on teiste meetodite ees mitmeid eeliseid (kõrge tundlikkus, spetsiifilisus, sõltumatus antagonistide olemasolust, täpse automatiseeritud arvestuse võimalus, arvestuse standardiseerimine). Sellel meetodil on aga ka omad piirangud: ELISA ei iseloomusta tsütokiinide bioloogilist aktiivsust ja võib anda valetulemusi ristreageerivate epitoopide tõttu.

bioloogiline testimine viiakse läbi teadmiste põhjal tsütokiinide põhiomadustest ja nende toimest sihtrakkudele. Tsütokiinide bioloogiliste mõjude uurimine on viinud nelja tüüpi tsütokiinide testimise väljatöötamiseni:

1) sihtrakkude proliferatsiooni esilekutsumisega;

2) tsütotoksilise toimega;

3) luuüdi eellasrakkude diferentseerumise esilekutsumisega;

4) viirusevastase toimega.

IL-1 määrab stimuleeriv toime hiire tümotsüütide proliferatsioonile, mida aktiveerib mitogeen in vitro; IL-2 - vastavalt võimele stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust; tsütotoksiliste mõjude suhtes hiire fibroblastidele (L929), testitakse TNFa-d ja lümfotoksiine. Kolooniaid stimuleerivaid tegureid hinnatakse nende võime järgi toetada luuüdi eellasrakkude kasvu agaril kolooniatena. IFN viirusevastast toimet tuvastatakse viiruste tsütopaatilise toime pärssimisega inimese diploidsete fibroblastide kultuuris ja hiire fibroblastide L-929 kasvajaliinis.

Loodud on rakuliinid, mille kasv sõltub teatud tsütokiinide olemasolust. Tabelis. 7.1 on loetelu rakuliinidest, mida kasutatakse tsütokiinide testimiseks. Vastavalt võimele indutseerida tundlike sihtrakkude proliferatsiooni viiakse läbi IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 jne biotestimine. Kuid need testimismeetodid ei ole väga tundlikud ja informatiivsed. Inhibiitori ja antagonisti molekulid võivad varjata tsütokiinide bioloogilist aktiivsust. Mõnedel tsütokiinidel on üldine bioloogiline aktiivsus. Sellest hoolimata on need meetodid ideaalsed rekombinantsete tsütokiinide spetsiifilise aktiivsuse testimiseks.

Tabel 7.1. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse testimiseks kasutatavad rakuliinid

Tabeli lõpp. 7.1

Labor 7-1

IL-1 bioloogilise aktiivsuse määramine selle komitogeense toime järgi hiire tümotsüütide proliferatsioonile

IL-1 bioloogilise testimise meetod põhineb tsütokiini võimel stimuleerida hiire tümotsüütide proliferatsiooni.

IL-1 saab määrata nii LPS-iga stimuleeritud monotsüütide kultuuris kui ka mis tahes kehavedelikus. Tähelepanu tuleb pöörata paljudele üksikasjadele.

1. Testimiseks kasutatakse C3H/HeJ hiirte tümotsüüte, mida on stimuleeritud mitogeenidega (koncanavaliin A – ConA ja fütohemaglutiniin – PHA) vohama. C3H/HeJ tümotsüüte ei valitud juhuslikult: selle sisearetatud liini hiired ei reageeri LPS-ile, mis võib esineda testitavas materjalis ja põhjustada IL-1 tootmist.

2. Tümotsüüdid reageerivad IL-2-le ja mitogeenidele, seetõttu tuleks IL-1 suhtes testitud preparaatides määrata ka IL-2 ja mitogeenide olemasolu.

Tööprotseduur

1. Valmistage tümotsüütide suspensioon kontsentratsiooniga 12 × 10 6 /ml söödet RPMI 1640, mis sisaldab 10% lehmaloote seerumit ja 2-merkaptoetanooli (5 × 10 -5 M).

2. Valmistatakse katse- (kehavedelike) ja kontrollproovide järjestikuste kahekordsete lahjenduste seeria. Kontrollidena kasutatakse IL-1 sisaldavaid bioloogilisi vedelikke või proove, mis on saadud mononukleaarsete rakkude inkubeerimisel ilma LPS-ita ja IL-1 sisaldavat laboratoorset standardpreparaati. 96 süvendiga ümarapõhjalistel plaatidel kantakse 50 µl igast lahjendusest 6 süvendisse.

3. Lisage iga lahjenduse kolme süvendisse 50 µl puhastatud PHA-d (Wellcome), mis on lahustatud täissöötmes kontsentratsiooniga 3 µg/ml, ja 50 µl söödet ülejäänud 3 süvendisse.

4. Lisage igasse süvendisse 50 µl tümotsüütide suspensiooni ja inkubeerige 48 tundi 37 °C juures.

6. Enne kultiveerimise lõpetamist lisatakse süvenditesse 50 μl [" 3 H]-tümidiini lahust (1 μCi / ml) ja inkubeeritakse veel 20 tundi.

7. Radioaktiivsuse taseme määramiseks kantakse kultuurirakud automaatse rakukoguja abil filterpaberile, filtrid kuivatatakse ja märgise kaasamine määratakseiga.

8. Tulemused on väljendatud stimulatsioonikoefitsiendina.

kus m cp on keskmine impulsside arv 3 augus.

Kui tümotsüüdid reageerivad stimulatsioonile standardse IL-1-ga, näitab uuritava proovi stimulatsiooniindeks, mis ületab 3, usaldusväärselt IL-1 aktiivsust.

Bioanalüüs on ainus meetod tsütokiini toimimise hindamiseks, kuid seda meetodit tuleks täiendada erinevat tüüpi sobivate spetsiifilisuse kontrollidega, kasutades monoklonaalseid antikehi. Teatud monoklonaalsete antikehade lisamine tsütokiinile kultuuris blokeerib tsütokiini bioloogilise aktiivsuse, mis tõestab, et rakuliini proliferatsiooni signaaliks on määratud tsütokiin.

Biotesti kasutamine interferooni tuvastamiseks. IFN-i bioloogilise aktiivsuse hindamise põhimõte põhineb selle viirusevastasel toimel, mille määrab uuritava viiruse paljunemise inhibeerimise määr rakukultuuris.

Töös saab kasutada IFN toime suhtes tundlikke rakke: algselt trüpsiinitud kana ja inimese embrüonaalseid fibroblastirakke, inimese diploidsete fibroblastide siirdatud rakke ja hiire rakukultuuri (L929).

IFN-i viirusevastase toime hindamisel on soovitav kasutada lühikese paljunemistsükliga, IFN-i toime suhtes kõrge tundlikkusega viiruseid: hiire entsefalomüeliidi viirus, hiire vesikulaarne stomatiit jne.

Labor 7-2

Interferooni aktiivsuse määramine

1. Inimese loote diploidsete fibroblastide suspensioon söötmel, mis sisaldab 10% veise embrüote seerumit (rakkude kontsentratsioon - 15-20 × 10 6 /ml), valatakse steriilsetele 96-süvendilistele lamedapõhjalistele plaatidele, 100 μl süvendi kohta ja asetatakse CO 2 -inkubaatoris temperatuuril 37 °C.

2. Pärast täieliku monokihi moodustumist eemaldatakse kasvusööde süvenditest ja igasse süvendisse lisatakse 100 µl säilitussöödet.

3. IFN aktiivsuse tiitrimine uuritavates proovides viiakse läbi kahekordsete lahjenduste meetodil fibroblastide monokihil.

Samaaegselt proovidega sisestatakse aukudesse hiire entsefalomüeliidi viirus (MEM) annuses, mis põhjustab 100% rakukahjustuse 48 tundi pärast nakatumist.

4. Kontrollidena kasutatakse intaktsete (töötlemata) viirusega nakatunud rakkudega süvendeid.

Igas uuringus kasutatakse võrdluspreparaatidena teadaoleva aktiivsusega IFN võrdlusproove.

5. Proovi lahjendusplaate inkubeeritakse 24 tundi 37 °C juures 5% CO 2 atmosfääris.

6. IFN aktiivsuse tase määratakse uuritava proovi maksimaalse lahjenduse vastastikuse väärtusega, mis aeglustab viiruse tsütopaatilist toimet 50% võrra, ja seda väljendatakse aktiivsuse ühikutes 1 ml kohta.

7. IFN tüübi määramiseks lisatakse süsteemi IFNα, IFNβ või IFNγ vastane antiseerum. Antiseerum tühistab vastava tsütokiini toime, mis võimaldab tuvastada IFN tüüpi.

Inhibeeriva faktori migratsiooni bioloogilise aktiivsuse määramine. Praegu on kujunenud täiesti uued ideed MÜÜTi olemuse ja omaduste kohta, mis avastati eelmise sajandi 60ndatel kui rakulise immuunsuse vahendaja ja jäeti paljudeks aastateks tähelepanuta (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R. , 1966). Alles viimase 10–15 aasta jooksul on selgunud, et MÜÜT on üks olulisemaid bioloogilisi vahendajaid organismis, millel on lai valik tsütokiini, hormooni ja ensüümi bioloogilisi funktsioone. MIF-i toime sihtrakkudele realiseerub CD74-retseptori või endotsütoosi mitteklassikalise raja kaudu.

MÜÜTI peetakse oluliseks põletikumediaatoriks, mis aktiveerib makrofaagide funktsiooni (tsütokiinide tootmine, fagotsütoos, tsütotoksilisus jne), samuti endogeenseks immunoregulatoorseks hormooniks, mis moduleerib glükokortikoidide aktiivsust.

Üha rohkem koguneb teavet MYTH rolli kohta paljude põletikuliste haiguste, sealhulgas sepsise, reumatoidartriidi (RA), glomerulonefriidi jne patogeneesis. RA korral suureneb MÜÜTi kontsentratsioon kahjustatud liigeste vedelikus oluliselt , mis on korrelatsioonis haiguse tõsidusega. MIF-i mõjul suureneb põletikueelsete tsütokiinide tootmine nii makrofaagide kui ka sünoviaalrakkude poolt.

MIF-i aktiivsuse testimiseks on erinevaid meetodeid, kui migreeruvad rakud (MIF-i sihtrakud) asetatakse klaaskapillaari (kapillaartest), agaroositilga või agaroosi süvendisse.

Tutvustame suhteliselt lihtsat sõelumismeetodit, mis põhineb raku mikrokultuuride (leukotsüüdid või makrofaagid) moodustamisel standardsete pindala ja rakkude arvu järgi 96-augulise lamedapõhjalise plaadi süvendite põhjas, millele järgneb nende kultiveerimine toitainekeskkonnas. ja nende mikrokultuuride pindala muutuse määramine MIF-i toimel (Suslov A.P., 1989).

Labor 7-3

MÜÜDI tegevuse definitsioon

MIF-i bioloogilise aktiivsuse määramine toimub raku mikrokultuuride moodustamiseks mõeldud seadme abil (joonis 7.7) - MIGROSCRIN (Vene Meditsiiniteaduste Akadeemia N. F. Gamaleya nime saanud epidemioloogia ja mikrobioloogia uurimisinstituut).

1. 96 süvendiga plaadi süvenditesse (Flow, UK või muu sarnane) lisage 100 µl söötmes lahjendatud proovi, milles määratakse MIF aktiivsus (iga lahjendus 4 paralleels, katseproovid). Kultuurisööde sisaldab RPMI 1640, 2 mM L-glutamiini, 5% veise loote seerumit, 40 μg/ml gentamütsiini.

2. Lisage kontrollsüvenditesse (4 paralleelselt) 100 µl söödet.

3. Valmistatakse kõhukelme makrofaagide rakususpensioon, mille jaoks süstitakse 2 hübriidhiirele (CBAxC57B1 / 6) F1 intraperitoneaalselt 10 ml Hanki lahust hepariiniga (10 U / ml), kõhtu masseeritakse õrnalt 2-3 minutit. . Seejärel loom tapetakse pea maharaiumisega, kõhusein torgatakse ettevaatlikult kubemepiirkonda ja eksudaat imetakse läbi nõela süstlaga välja. Peritoneaalse eksudaadi rakke pestakse kaks korda Hanki lahusega, tsentrifuugides neid 10-15 minutit 200 g juures. Seejärel valmistatakse rakususpensioon kontsentratsiooniga 10 ± 1 miljonit/ml söötmega RPMI 1640. Loendamine viiakse läbi Gorjajevi kambris.

4. Kokku on monteeritud MIGROSCRIN-süsteem, mis on 96-augulise kultuuriplaadi süvendi keskpunkti kohal etteantud kõrgusel rakukultuuridega otste suuna- ja standardfiksatsiooni alus, mis sisaldab ka 92 otsikut. USA-st Costari automaatpipeti jaoks (joonis .7.7).

Sisestage statiivi jalad plaadi nurgasüvenditesse. Rakususpensioon kogutakse automaatse pipetiga otsikutesse – igaüks 5 μl, loputatakse liigsetest rakkudest ühekordse söötmesse kastmise teel ja sisestatakse vertikaalselt süsteemialuse pesadesse. Otsikutega täidetud resti hoitakse 1 tund toatemperatuuril rangelt horisontaalsel pinnal. Selle aja jooksul settivad suspensiooni rakud süvendite põhja, kus moodustuvad standardsed raku mikrokultuurid.

5. Eemaldage ettevaatlikult plaadilt otsik. Rakkude mikrokultuuriga plaat asetatakse rangelt horisontaalsesse asendisse CO 2 inkubaatorisse, kus seda kultiveeritakse 20 tundi.Kasvatamise ajal migreeruvad rakud piki kaevu põhja.

6. Tulemuste kvantifitseerimine pärast inkubeerimist viiakse läbi binokulaarsel luubil, hinnates visuaalselt koloonia suurust okulaari sees oleval skaalal. Mikrokultuurid on ringikujulised. Seejärel määravad uurijad kolooniate keskmise läbimõõdu 4 katse- või kontrollkaevu kolooniate mõõtmise tulemuste põhjal. Mõõtmisviga on ±1 mm.

Migratsiooniindeks (MI) arvutatakse järgmise valemiga:

Proovil on MÜÜT aktiivsus, kui MI väärtused on võrdsed

MYTH aktiivsuse kokkuleppelise ühiku (U) puhul võetakse pöördväärtus võrdseks proovi (proovi) suurima lahjenduse väärtusega, mille migratsiooniindeks on 0,6 ± 0,2.

PEO bioloogiline aktiivsusα on hinnatud selle tsütotoksilise toime järgi transformeeritud fibroblastide L-929 liinile. Positiivse kontrollina kasutatakse rekombinantset TNFa-d ja negatiivse kontrollina söötmes olevaid rakke.

Tsütotoksilisuse indeks (CI) arvutatakse:

kus a- elusrakkude arv kontrollis; b- elusrakkude arv katses.

Riis. 7.7. Skeem MIGROSCRIN - seadmed rakukultuuride migratsiooni kvantitatiivseks hindamiseks

Rakud värvitakse värvainega (metüleensinine), mis sisaldub ainult surnud rakkudes.

TNF-i aktiivsuse tavapärase ühiku jaoks võetakse proovi pöördlahjenduse väärtus, mis on vajalik 50% rakulise tsütotoksilisuse saamiseks. Proovi eriaktiivsus on aktiivsuse suhe suvalistes ühikutes 1 ml kohta proovis sisalduva valgu kontsentratsiooniga.

Intratsellulaarne tsütokiinide värvimine. Erinevaid tsütokiine tootvate rakkude vahekorra muutus võib peegeldada haiguse patogeneesi ning olla haiguse prognoosi ja ravi hindamise kriteeriumiks.

Intratsellulaarse värvimise meetod määrab tsütokiini ekspressiooni ühe raku tasemel. Voolutsütomeetria võimaldab teil lugeda konkreetset tsütokiini ekspresseerivate rakkude arvu.

Loetleme peamised etapid intratsellulaarsete tsütokiinide määramisel.

Stimuleerimata rakud toodavad väikeses koguses tsütokiine, mis reeglina ei ladestu, seetõttu on intratsellulaarsete tsütokiinide hindamisel oluline samm lümfotsüütide stimuleerimine ja nende produktide rakkudest vabanemise blokeerimine.

Tsütokiini indutseerijana kasutatakse kõige sagedamini proteiinkinaasi C aktivaatorit forbol-12-müristaat-13-atsetaati (PMA) kombinatsioonis kaltsiumionofoori ionomütsiiniga (IN). Selle kombinatsiooni kasutamine põhjustab paljude tsütokiinide sünteesi: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. FMA-IN kasutamise puuduseks on probleem CD4 molekulide tuvastamisel lümfotsüütide pinnal pärast sellist aktiveerimist. Samuti indutseeritakse mitogeene (PGA) kasutades tsütokiinide tootmist T-lümfotsüütide poolt. B-rakud ja monotsüüdid stimuleerivad

Mononukleaarseid rakke inkubeeritakse tsütokiinide tootmise indutseerijate ja nende rakusisese transpordi blokaatori, brefeldiin A või monensiini juuresolekul 2-6 tundi.

Seejärel resuspendeeritakse rakud puhverlahuses. Fikseerimiseks lisada 2% formaldehüüdi, inkubeerida 10-15 min toatemperatuuril.

Seejärel töödeldakse rakke saponiiniga, mis suurendab rakumembraani läbilaskvust, ja värvitakse määratavatele tsütokiinidele spetsiifiliste monoklonaalsete antikehadega. Pinnamarkerite (CD4, CD8) eelvärvimine suurendab raku kohta saadava informatsiooni hulka ja võimaldab täpsemalt määrata selle populatsioonikuuluvust.

Eespool kirjeldatud meetodite rakendamisel on mõned piirangud. Seega on neid kasutades võimatu analüüsida tsütokiinide sünteesi ühe raku poolt, võimatu on määrata tsütokiini tootvate rakkude arvu alampopulatsioonis, võimatu on kindlaks teha, kas tsütokiini tootvad rakud ekspresseerivad unikaalseid markereid, kas erinevad. tsütokiine sünteesivad erinevad rakud või samad rakud. Vastus neile küsimustele saadakse teiste uurimismeetodite abil. Tsütokiine tootvate rakkude esinemissageduse määramiseks populatsioonis kasutatakse piiravat lahjendusmeetodit ja ensüümseotud immunosorbentanalüüsi ELISPOT varianti (vt ptk 4).

In situ hübridisatsiooni meetod. Meetod sisaldab:

2) fikseerimine paraformaldehüüdiga;

3) mRNA tuvastamine märgistatud cDNA abil. Mõnel juhul määratakse tsütokiini mRNA sektsioonides radioisotoopide PCR abil.

Immunofluorestsents. Meetod sisaldab:

1) elundi külmutamine ja krüostaadi sektsioonide valmistamine;

2) fikseerimine;

3) lõikude töötlemine fluorestseiiniga märgistatud tsütokiinivastaste antikehadega;

4) fluorestsentsi visuaalne jälgimine.

Need tehnikad (hübridiseerimine kohapeal ja immunofluorestsents) on kiired ega sõltu sekreteeritava toote lävikontsentratsioonist. Kuid need ei määra sekreteeritava tsütokiini kogust ja võivad olla tehniliselt keerulised. Vajalik on mitmesugune hoolikas jälgimine mittespetsiifiliste reaktsioonide suhtes.

Kasutades esitatud meetodeid tsütokiinide hindamiseks, tuvastati patoloogilised protsessid, mis on seotud tsütokiinisüsteemi erinevatel tasanditel esinevate häiretega.

Seega on tsütokiinisüsteemi hindamine organismi immuunsüsteemi seisundi iseloomustamiseks äärmiselt oluline. Tsütokiinisüsteemi erinevate tasemete uurimine võimaldab saada teavet erinevat tüüpi immunokompetentsete rakkude funktsionaalse aktiivsuse, põletikulise protsessi raskusastme, selle ülemineku kohta süsteemsele tasemele ja haiguse prognoosi kohta.

Küsimused ja ülesanded

1. Loetlege tsütokiinide üldised omadused.

2. Esitage tsütokiinide klassifikatsioon.

3. Loetlege tsütokiinisüsteemi põhikomponendid.

4. Loetlege tsütokiini tootvad rakud.

5. Kirjeldage tsütokiini retseptorite perekondi.

6. Millised on tsütokiinide võrgustiku toimimise mehhanismid?

7. Rääkige meile tsütokiinide tootmisest kaasasündinud immuunsüsteemis.

8. Millised on tsütokiinisüsteemi kompleksse hindamise peamised lähenemisviisid?

9. Millised on kehavedelike tsütokiinide testimise meetodid?

10. Millised on tsütokiinisüsteemi defektid erinevate patoloogiate korral?

11. Millised on peamised meetodid IL-1, IFN, MIF, TNFa bioloogiliseks testimiseks bioloogilistes vedelikes?

12. Kirjeldage tsütokiinide rakusisese sisalduse määramise protsessi.

13. Kirjeldage ühe raku poolt eritatavate tsütokiinide määramise protsessi.

14. Kirjeldage meetodite järjestust, mida kasutatakse defekti tuvastamiseks tsütokiini retseptori tasemel.

15. Kirjeldage meetodite järjestust, mida kasutatakse defekti tuvastamiseks tsütokiini tootvate rakkude tasemel.

16. Millist teavet saab, kui uurida tsütokiinide tootmist mononukleaarsete rakkude kultuuris, vereseerumis?

TSÜTOKIINIDE MÄÄRAMISE MEETODID

S.V. Sennikov, A.N. Silkov

Ülevaade on pühendatud praegu kasutatavatele tsütokiinide uurimise peamistele meetoditele. Lühidalt iseloomustatakse meetodite võimalusi ja eesmärki. Esitatakse erinevate lähenemisviiside eelised ja puudused tsütokiini geeniekspressiooni analüüsimisel nukleiinhapete tasemel ja valgu tootmise tasemel. (Tsütokiinid ja põletikud. 2005. V. 4, nr 1. S. 22-27.)

Märksõnad:ülevaade, tsütokiinid, määramismeetodid.

Sissejuhatus

Tsütokiinid on reguleerivad valgud, mis moodustavad universaalse vahendajate võrgustiku, mis on iseloomulik nii immuunsüsteemile kui ka teiste organite ja kudede rakkudele. Selle regulatoorsete valkude klassi kontrolli all toimuvad kõik rakulised sündmused: proliferatsioon, diferentseerumine, apoptoos ja rakkude spetsiifiline funktsionaalne aktiivsus. Iga tsütokiini mõju rakkudele iseloomustab pleiotroopia, erinevate vahendajate mõjude ulatus kattub ja üldiselt sõltub raku lõplik funktsionaalne seisund mitmete sünergistlikult toimivate tsütokiinide mõjust. Seega on tsütokiinisüsteem universaalne, polümorfne reguleeriv vahendajate võrgustik, mille eesmärk on kontrollida rakuliste elementide proliferatsiooni, diferentseerumist, apoptoosi ja funktsionaalset aktiivsust keha vereloome-, immuun- ja teistes homöostaatilistes süsteemides.

Esimeste tsütokiinide kirjeldamisest on möödunud vähe aega. Nende uurimistöö viis aga ulatusliku teadmiste osa eraldamiseni - tsütokinoloogia, mis on erinevate teadmiste valdkondade lahutamatu osa, ja ennekõike immunoloogia, mis andis nende vahendajate uurimisele võimsa tõuke. Tsütokinoloogia läbib kõiki kliinilisi distsipliine, alates haiguste etioloogiast ja patogeneesist kuni erinevate patoloogiliste seisundite ennetamise ja ravini. Seetõttu peavad teadlased ja arstid navigeerima reguleerivate molekulide mitmekesisuses ja omama selget arusaama iga tsütokiini rollist uuritavates protsessides.

Tsütokiinide määramise meetodid 20-aastase intensiivse uurimise jooksul on läbinud väga kiire arengu ja esindavad tänapäeval tervet teaduslike teadmiste valdkonda. Töö alguses seisavad tsütokinoloogia teadlased meetodi valiku küsimuse ees. Ja siin peab uurija täpselt teadma, millist infot on tal vaja eesmärgi saavutamiseks hankida. Praeguseks on tsütokiinisüsteemi hindamiseks välja töötatud sadu erinevaid meetodeid, mis annavad selle süsteemi kohta mitmekesist teavet. Tsütokiine saab hinnata erinevates bioloogilistes keskkondades nende spetsiifilise bioloogilise aktiivsuse järgi. Neid saab kvantifitseerida, kasutades erinevaid immunoanalüüsi meetodeid, kasutades polü- ja monoklonaalseid antikehi. Lisaks tsütokiinide sekretoorsete vormide uurimisele saab uurida nende rakusisest sisaldust ja tootmist kudedes voolutsütomeetria, Western blot analüüsi ja in situ immunohistokeemia abil. Väga olulist teavet saab tsütokiini mRNA ekspressiooni, mRNA stabiilsuse, tsütokiini mRNA isovormide olemasolu ja looduslike antisenss-nukleotiidjärjestuste uurimisel. Tsütokiini geenide alleelsete variantide uurimine võib anda olulist teavet konkreetse vahendaja geneetiliselt programmeeritud kõrge või madala produktsiooni kohta. Igal meetodil on oma eelised ja puudused, oma eraldusvõime ja määramise täpsus. Teadmatus ja nende nüansside mittemõistmine teadlase poolt võib viia ta valejäreldusteni.

Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramine

Avastuse ajalugu ja esimesed sammud tsütokiinide uurimisel olid tihedalt seotud immunokompetentsete rakkude ja rakuliinide kasvatamisega. Seejärel näidati mitmete lahustuvate valgufaktorite regulatiivset toimet (bioloogilist aktiivsust) lümfotsüütide proliferatiivsele aktiivsusele, immunoglobuliinide sünteesile ja immuunvastuste tekkele in vitro mudelites. Üks esimesi meetodeid vahendajate bioloogilise aktiivsuse määramiseks on inimese lümfotsüütide migratsioonifaktori ja selle inhibeerimisfaktori määramine. Kuna hakati uurima tsütokiinide bioloogilist mõju, siis ilmnesid ka erinevad meetodid nende bioloogilise aktiivsuse hindamiseks. Niisiis määrati IL-1, hinnates hiire tümotsüütide proliferatsiooni in vitro, IL-2 - võimet stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust, IL-3 - vereloome kolooniate kasvuga in vitro, IL-4 - vastavalt võimele stimuleerida lümfoblastide proliferatiivset aktiivsust. komitogeenne toime, suurendades Ia valkude ekspressiooni, indutseerides IgG1 ja IgE moodustumist jne. . Nende meetodite loetelu võib jätkata, seda ajakohastatakse pidevalt, kui avastatakse lahustuvate tegurite uusi bioloogilisi aktiivsusi. Nende peamine puudus on mittestandardsed meetodid, nende ühendamise võimatus. Tsütokiinide bioloogilise aktiivsuse määramise meetodite edasiarendamine on viinud suure hulga ühe või teise tsütokiini suhtes tundlike rakuliinide ehk multisensitiivsete liinide loomiseni. Enamikku neist tsütokiinidele reageerivatest rakkudest võib nüüd leida kaubanduslikult saadavate rakuliinide loendist. Näiteks IL-1a ja b testimiseks kasutatakse D10S rakuliini, IL-2 ja IL-15 puhul CTLL-2 rakuliini, IL-3, IL-4, IL-5, IL jaoks. -9, IL-13, GM-CSF - rakuliin TF-1, IL-6 jaoks - rakuliin B9, IL-7 jaoks - rakuliin 2E8, TNFa ja TNFb - rakuliin L929, IFNg - rakuliin WiDr IL-18 jaoks - rakuliin KG-1.

Kuid sellisel lähenemisel immunoaktiivsete valkude uurimisele on koos tuntud eelistega, nagu küpsete ja aktiivsete valkude tegeliku bioloogilise aktiivsuse mõõtmine, kõrge reprodutseeritavus standardtingimustes, omad puudused. Nende hulka kuuluvad ennekõike rakuliinide tundlikkus mitte ühe tsütokiini, vaid mitme seotud tsütokiini suhtes, mille bioloogilised toimed kattuvad. Lisaks ei saa välistada võimalust indutseerida sihtrakkude poolt teiste tsütokiinide tootmist, mis võivad testiparameetrit moonutada (reeglina on need proliferatsioon, tsütotoksilisus, kemotaksis). Me ei tea veel kõiki tsütokiine ja mitte kõiki nende mõjusid, seega ei hinda me mitte tsütokiini ennast, vaid kogu spetsiifilist bioloogilist aktiivsust. Seega on bioloogilise aktiivsuse hindamine erinevate vahendajate koguaktiivsusena (ebapiisav spetsiifilisus) selle meetodi üks puudusi. Lisaks ei ole tsütokiinitundlike liinide abil võimalik tuvastada aktiveerimata molekule ja nendega seotud valke. See tähendab, et sellised meetodid ei kajasta paljude tsütokiinide tegelikku tootmist. Teine oluline rakuliinide kasutamise puudus on vajadus rakukultuuri labori järele. Lisaks nõuavad palju aega kõik protseduurid rakkude kasvatamiseks ja nende inkubeerimiseks uuritud valkude ja söötmega. Samuti tuleb märkida, et rakuliinide pikaajaline kasutamine nõuab uuendamist või uuesti sertifitseerimist, kuna kultiveerimise tulemusena võivad need muteeruda ja muutuda, mis võib viia nende tundlikkuse muutumiseni vahendajate suhtes ja täpsuse vähenemiseni. bioloogilise aktiivsuse määramiseks. See meetod sobib aga ideaalselt rekombinantsete vahendajate spetsiifilise bioloogilise aktiivsuse testimiseks.

Tsütokiinide kvantifitseerimine antikehade abil

Immunokompetentsete ja teiste rakutüüpide toodetud tsütokiinid vabanevad rakkudevahelisse ruumi parakriinsete ja autokriinsete signaalide interaktsioonide jaoks. Nende valkude kontsentratsiooni järgi vereseerumis või konditsioneeritud keskkonnas saab hinnata patoloogilise protsessi olemust ja teatud rakufunktsioonide üle- või puudulikkust patsiendil.

Tsütokiinide määramise meetodid spetsiifiliste antikehade abil on praegu nende valkude kõige levinumad tuvastamissüsteemid. Need meetodid läbisid terve rea modifikatsioone, kasutades erinevaid märgiseid (radioisotoop, fluorestsents, elektrokemoluminestsents, ensümaatiline jne). Kui radioisotoopide meetoditel on mitmeid puudusi, mis on seotud radioaktiivse märgise kasutamisega ja märgistatud reaktiivide kasutamise piiratud ajaga (poolväärtusaeg), siis kõige laialdasemalt kasutatakse ensüümi immuunanalüüsi meetodeid. Need põhinevad ensümaatilise reaktsiooni lahustumatute saaduste visualiseerimisel, mis neelavad teadaoleva lainepikkusega valgust koguses, mis on samaväärne analüüdi kontsentratsiooniga. Mõõdetavate ainete sidumiseks kasutatakse tahkele polümeeralusele kaetud antikehi ja ensüümidega konjugeeritud antikehi pildistamiseks, tavaliselt aluselise fosfataasi või mädarõika peroksidaasiga.

Meetodi eelised on ilmsed: see on kõrge määramistäpsus standardiseeritud tingimustes reaktiivide säilitamiseks ja protseduuride läbiviimiseks, kvantitatiivne analüüs ja reprodutseeritavus. Puuduseks on määratud kontsentratsioonide piiratud vahemik, mille tulemusena loetakse kõik teatud läve ületavad kontsentratsioonid sellega võrdseks. Tuleb märkida, et meetodi täitmiseks kuluv aeg varieerub sõltuvalt tootja soovitustest. Kuid igal juhul räägime mitmest tunnist, mis kulub inkubeerimiseks ja reaktiivide pesemiseks. Lisaks määratakse tsütokiinide varjatud ja seotud vormid, mis oma kontsentratsioonis võivad oluliselt ületada vabu vorme, mis vastutavad peamiselt vahendaja bioloogilise aktiivsuse eest. Seetõttu on soovitav kasutada seda meetodit koos vahendaja bioloogilise aktiivsuse hindamise meetoditega.

Immunoanalüüsi meetodi teine ​​modifikatsioon, mis on leidnud laialdast rakendust, on elektrokemoluminestsentsmeetod (ECL) valkude määramiseks ruteeniumi ja biotiiniga märgistatud antikehadega. Sellel meetodil on radioisotoopide ja ensüümide immunoanalüüsidega võrreldes järgmised eelised: rakendamise lihtsus, lühike teostusaeg, pesemisprotseduuride puudumine, väike proovi maht, suur tsütokiinide kontsentratsioonivahemik seerumis ja konditsioneeritud söötmes, meetodi kõrge tundlikkus ja reprodutseeritavus. . Vaadeldav meetod on vastuvõetav kasutamiseks nii teadusuuringutes kui ka kliinilistes uuringutes.

Järgmine meetod tsütokiinide hindamiseks bioloogilises keskkonnas põhineb voolufluoromeetria tehnoloogial. See võimaldab teil üheaegselt hinnata kuni sadat proovis olevat valku. Praegu on kaubanduslikud komplektid loodud kuni 17 tsütokiini määramiseks. Kuid selle meetodi eelised määravad ka selle puudused. Esiteks on see mitme valgu määramiseks optimaalsete tingimuste valimise töömahukus ja teiseks on tsütokiinide tootmine looduses kaskaadiline, mille tootmispiigid on erinevatel aegadel. Seetõttu ei ole suure hulga valkude samaaegne määramine alati informatiivne.

Immuunanalüüsi meetodite üldine nõue, kasutades nn. "võileib" on antikehade paari hoolikas valik, mis võimaldab määrata analüüsitava valgu vaba või seotud vormi, mis seab sellele meetodile piirangud ja mida tuleb saadud andmete tõlgendamisel alati arvesse võtta. . Need meetodid määravad tsütokiinide koguproduktsiooni erinevate rakkude poolt, samal ajal kui immunokompetentsete rakkude antigeenispetsiifilist tsütokiinide tootmist saab hinnata ainult esialgselt.

Praeguseks on välja töötatud ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot) süsteem, mis need puudused suures osas kõrvaldab. Meetod võimaldab poolkvantitatiivselt hinnata tsütokiinide tootmist üksikute rakkude tasemel. Selle meetodi kõrge eraldusvõime võimaldab hinnata antigeeniga stimuleeritud tsütokiinide tootmist, mis on spetsiifilise immuunvastuse hindamisel väga oluline.

Järgmine, teaduslikel eesmärkidel laialdaselt kasutatav meetod on tsütokiinide rakusisene määramine voolutsütomeetria abil. Selle eelised on ilmsed. Me saame fenotüüpiliselt iseloomustada tsütokiini tootvate rakkude populatsiooni ja/või määrata üksikute rakkude poolt toodetud tsütokiinide spektrit ning seda tootmist on võimalik suhteliselt iseloomustada. Kirjeldatud meetod on aga üsna keeruline ja nõuab kalleid seadmeid.

Järgmised meetodid, mida kasutatakse peamiselt teaduslikel eesmärkidel, on immunohistokeemilised meetodid, mis kasutavad märgistatud monoklonaalseid antikehi. Eelised on ilmsed – tsütokiinide tootmise määramine otse kudedes (in situ), kus toimuvad mitmesugused immunoloogilised reaktsioonid. Vaadeldavad meetodid on aga väga töömahukad ega anna täpseid kvantitatiivseid andmeid.

Tsütokiinid hõlmavad mitmesuguseid valke molekulmassiga 15-40 kDa, mida sünteesivad erinevad keharakud. Tsütokiinid on molekulid, mis tagavad immuunsüsteemi, veresoonte endoteeli, närvisüsteemi ja maksa rakkude vastasmõju. Praegu on teada rohkem kui 200 tsütokiini.

Samu tsütokiine võivad sünteesida erinevat tüüpi rakud – immuunsüsteem, põrn, harknääre, sidekude. Teisest küljest on konkreetne rakk võimeline tootma palju erinevaid tsütokiine. Suurima hulga tsütokiine moodustavad lümfotsüüdid, tänu sellele interakteerub lümfotsüütiline immuunsus teiste immuunmehhanismidega ja organismiga tervikuna.

Tsütokiinide oluline omadus, erinevalt hormoonidest ja teistest signaalmolekulidest, on nende toime erinevatele rakkudele sama, erinev või isegi vastupidine. Need. Tsütokiini mõju lõpptulemus ei sõltu selle tüübist, vaid sihtraku sisemisest programmist, tema individuaalsetest ülesannetest!

Tsütokiinide funktsioonid

Tsütokiinide rolli keha funktsioonide reguleerimisel võib jagada neljaks põhikomponendiks:

1. Elundite, sealhulgas immuunsüsteemi organite embrüogeneesi, munemise ja arengu reguleerimine.

2. Kudede kasvuprotsesside reguleerimine:

3. Üksikute füsioloogiliste funktsioonide reguleerimine:

• rakkude funktsionaalse aktiivsuse tagamine,
• endokriin-, immuun- ja närvisüsteemi reaktsioonide koordineerimine,
• keha homöostaasi (dünaamilise püsivuse) säilitamine.

4. Organismi kaitsereaktsioonide reguleerimine kohalikul ja süsteemsel tasandil:

• muutused immuunvastuse kestuses ja intensiivsuses (keha kasvaja- ja viirusevastane kaitse),
• põletikuliste reaktsioonide moduleerimine,
• osalemine autoimmuunreaktsioonide arengus.
• rakkude kasvu stimuleerimine või pärssimine,
• osalemine hematopoeesi protsessis.